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背景与目的凋亡抑制蛋白（IAPs）是一类重要的抗凋亡蛋白，它在肿瘤发生、发展及肿瘤治疗的抵抗中发挥重要的作用。它可以直接结合并抑制起始和效应caspase分子，对线粒体及Fas介导的凋亡均可发挥抑制作用，与其他的可抑制上游caspases的蛋白不同，IAPs可抑制始动及效应caspase分子活性，XIAP（X-linked inhibitor of apoptosis）是IAP家族中活性最强的成员，它可以保护细胞免受凋亡，它的抗凋亡作用可以被XAF1（XIAP-associated factor 1）下调抑制。XAF1是新近发现，被认为是一个抑癌基因，它在正常成人组织和胚胎组织中表达，而在肿瘤组织中缺失或低表达。目前研究认为，XAF1的作用机制是通过直接结合并拮抗XIAP对caspase的抑制作用从而发挥诱导凋亡作用。然而XAF1对细胞生长的直接作用及其机制，尚未有研究报道。本研究中，通过建立稳定转染XAF1基因的AGS细胞株，观察XAF1过表达对AGS细胞生长和凋亡的影响与形态学变化，探索新的XAF1作用机制。方法将质粒pcDNA3.1、pcDNA3.1-XAF1-S和pcDNA3.1-XAF1-AS稳定转染AGS细胞，分别命名为AGS／vector，AGS／XAF1和AGS／XAF1-AS，Western-blot检测稳定转染株XAF1蛋白的表达。将AGS细胞同步化到S期后释放生长，测同步化后0、2、4、6小时的细胞周期分布及XAF1蛋白的表达。MTT法检测转染XAF1后对细胞的增殖的影响。流式细胞仪检测AGS／vector，AGS／XAF1细胞的细胞周期。将pDsred2-N1-XAF1瞬时转染细胞，免疫细胞化学检测有丝分裂期表达蛋白—MPM-2磷酸化蛋白的表达，同时检测稳定转染株中MPM-2磷蛋白的表达。用Hoechst 22358核染色观察瞬时转染和稳定转染XAF1后AGS细胞核的形态变化，用-微管蛋白抗体免疫细胞化学检测稳定转染株内中心小体的变化。用无血清培养建立凋亡刺激模型，流式细胞仪检测XAF1对凋亡刺激的影响，Hoechst 22358核染色观察凋亡，Western-blot检测活性caspase-3表达变化。结果1)建立了稳定表达XAF1的AGS／XAF1细胞克隆：Western-blot检测显示AGS／XAF1细胞的XAF1表达上调，AGS／XAF1-AS的XAF1表达下调。2) XAF1是G2／M期特异表达蛋白：AGS细胞同步化到S期后释放生长，同步化后2h的细胞75.95％分布在G2／M期、4h的细胞76.45％分布在G2／M期，6h时段的细胞只有21.56％分布在G2／M期；同时Western检测同步化后2、4h的细胞XAF1蛋白的表达显著高于0、6h时段。3) XAF1抑制细胞生长：通过MTT检测细胞增殖，与对照组相比转染XAF1后细胞生长被抑制，转染反义XAF1则相反。4) XAF1过表达致G2／M期阻滞：流式细胞仪检测AGS／XAF1细胞中有75％左右处于G2／M期，而AGS／vector细胞中只有30％处于G2／M期。AGS／XAF1细胞中MPM-2表达阳性占27.3±1.3％，AGS／vector中占8.4±0.5％，差异有统计学意义。5) XAF1过表达致有丝分裂障碍：AGS／XAF1细胞Hoechst 22358核染色后观察，没有发现典型的凋亡形态学特征，有46.5％的细胞出了多倍体核，与有丝分裂障碍的描述一致。并且约25％的AGS／XAF1细胞中出现3个或3个以上的中心体，甚至有一些细胞出现10个以上的中心体。6) XAF1过表达增加了对凋亡的敏感性：在血清剥夺诱导凋亡的刺激下，AGS／XAF1细胞的凋亡数明显高于对照组，并且和对照组相比活性形式的裂解caspase-3的表达增加。结论本研究提示使AGS细胞发生有丝分裂障碍可能是XAF1不依赖于XIAP途径的一种新的作用机制，XAF1可能为一个新的细胞周期调控蛋白，为将XAF1作为肿瘤治疗的靶基因提供了进一步的依据。