研究背景:子痫前期（preeclampsia,PE）是一种常见且严重的妊娠并发症,定义为妊娠20周后新发的高血压和终末器官损害,包括蛋白尿,与相当大的母婴发病率与死亡率相关。PE发病原因多样,病理过程复杂,至今对其详细的发病机制仍不明晰。研究认为慢性子宫胎盘缺血,滋养细胞凋亡和坏死增多等可能诱发或参与PE的发生。已有研究表明,PE时会出现滋养细胞的非正常分化、侵袭能力低下、凋亡过度等现象,导致子宫螺旋动脉重铸异常,使母胎之间发生血运障碍,从而引起一系列临床症状如高血压、蛋白尿等,但是导致滋养细胞功能异常的原因目前仍鲜少报道。核心蛋白聚糖（Decorin,DCN）为一富含亮氨酸的小分子蛋白聚糖,是由糖胺聚糖（Glycosaminoglycan,GAG）链通过共价键与核心蛋白连接组成。为细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）的重要组成成分,通过与生长因子等结合,参与调节细胞生长及组织重塑过程。最近研究发现DCN与滋养层侵袭不足、血管内皮损伤密切相关,可能通过和不同酪氨酸激酶受体（tyrosine kinase receptor,TKR）等结合,引起滋养细胞的增殖和迁移能力减弱,致血管生成障碍,进而参与调控子痫前期的病理生理过程。细胞间质上皮转换因子（cellular-mesenchymal epithelial transition factor,c-Met）受体由α链和β链通过二硫键连接组成,是一酪氨酸激酶型受体。通过激活β链上的酪氨酸激酶区域,使c-Met自动磷酸化,进一步招募并磷酸化下游信号分子,导致一系列细胞生物学效应的发生。β链是配体肝细胞生长因子（HGF）结合c-Met受体后引起信号转导的触发区。HGF/c-Met在细胞存活、胚胎发生、细胞迁移和入侵过程中具有关键作用。研究发现,在肿瘤细胞中,DCN是c-Met受体的拮抗配体,DCN可直接与c-Met受体结合,通过胞外域脱落和内化,下调c-Met表达,进而改变细胞的生物学行为。自噬是在应激状态下维持细胞内平衡的一种机制,是一种自我降解过程,从细胞质内容物中产生能量,防止废弃物的积累。在自噬的相关研究中,Beclin-1（自噬执行蛋白）、LC3（自噬体形成蛋白标记分子）及p62是常用的检测指标。文献报道,PE时Beclin-1和LC3Ⅱ在胎盘中表达增加,提示PE滋养细胞中存在自噬异常现象。此外,前期研究结果显示,c-Met和DCN都参与调控细胞自噬的形成过程。鉴于绒毛外滋养细胞（extravilloustrophoblasts,EVT）与肿瘤细胞局域极其相似的生物学行为,我们推测DCN可能通过c-Met调控EVT的增殖、凋亡、迁移和侵袭能力,并且借助对c-Met的抑制,增强细胞自噬,介入PE的发生发展的调控。本研究旨在通过探究DCN和c-Met在调节滋养细胞功能中的作用,阐明DCN调控PE发病过程的具体分子机制具体,为发现PE新的预测手段和干预措施奠定坚实的理论基础。第一部分:PE患者DCN、c-Met以及自噬相关蛋白的表达研究目的:研究PE组及正常组受孕妇女孕晚期外周血DCN浓度,DCN、c-Met、自噬蛋白Beclin-1和LC3在胎盘中的表达量,明确DCN和c-Met在PE发病进程中的作用;研究PE组、妊娠期高血压组及正常组受孕妇女孕中期外周血中DCN浓度,明确DCN是否可以作为孕中期预测PE发生的标志性蛋白。研究方法:选取在温州市人民医院2018.1至2019.12住院分娩孕妇为研究对象,患PE孕妇42例为PE组,同期健康孕妇43例为正常组。采用ELISA法检测两组产妇孕晚期血清及胎盘组织中DCN水平,胎盘组织中c-Met的水平;采用Western blot技术检测胎盘中c-Met、Beclin-1和LC3的蛋白表达。另借助该院生物样本库,共收集孕中期血清标本78例,PE病例31例（其中重度PE病例10例、早发型重度PE 6例）,妊娠期高血压病例5例,正常组42例,分别检测其DCN水平。研究结果:1.ELISA法实验结果表明,孕晚期PE组血清和胎盘组织中DCN水平显著高于正常组。另外,孕中期PE组血清中DCN水平也明显高于正常组,且早发型重度PE组DCN含量升高更显著。2.分别用ELISA法和Western blot法检测胎盘中的c-Met蛋白水平及表达,结果显示,PE组胎盘中c-Met蛋白的含量及表达水平均有明显降低。3.Western blot检测发现,PE组Beclin-1和LC3蛋白在胎盘组织中较正常组增加。研究结论:1.PE组孕晚期孕妇的血清及胎盘中的DCN较正常组高,说明DCN可能参与PE的发生。2.孕中期血清中DCN水平可以作为一个预测PE发生的关键蛋白。3.c-Met蛋白在PE组胎盘组织中表达明显降低,说明c-Met的低表达水平可能是PE胎盘滋养细胞病变的主要原因。4.PE组,Beclin-1和LC3表达明显上调,表明PE引起自噬活动增强。第二部分:DCN对滋养细胞功能的调控及对c-Met的影响研究目的:为研究DCN调控滋养细胞生物学功能的作用,我们将设定不同浓度的DCN处理HTR-8/SVneo细胞,检测细胞增殖迁移等功能,明确DCN对滋养细胞功能的影响及是否存在剂量依赖性。另外,我们采用Western blot法检测DCN处理后c-Met蛋白的表达,明确DCN对滋养细胞中c-Met的影响。研究方法:1.购置人类绒毛外滋养细胞株HTR-8/SVneo（HTR-8）并传代培养,对不同浓度DCN处理后的细胞,进行CCK8法、RTCA、细胞划痕迁移实验、Transwell和细胞凋亡实验,检测细胞的增殖、侵袭、迁移及凋亡情况。2.采用Western blot技术检测不同浓度的DCN处理后HTR-8细胞p-Met、c-Met蛋白的表达水平。研究结果:1.CCK8实验和RTCA实验显示,暴露于不同浓度的DCN后,HTR-8细胞的增殖能力和存活率随着DCN浓度的增加而降低。2.细胞划痕迁移实验和Transwell迁移侵袭实验显示,DCN随着浓度的增加,抑制HTR-8细胞迁移和侵袭的效果越明显。3.细胞凋亡实验结果表明,DCN能显著增加HTR-8细胞的凋亡率。4.Western blot显示短时暴露于DCN 10分钟,激活c-Met的Tyr1234/5磷酸化,但是15分钟后c-Met的磷酸化水平急剧下降;DCN长时间孵育持续抑制c-Met的磷酸化,且以剂量依赖方式下调c-Met的表达。研究结论:1.DCN随着浓度的增加,对HTR-8细胞的增殖、迁移和侵袭的抑制效果更加明显,且显著促进滋养细胞的凋亡。2.DCN短时间内作用,可激活c-Met磷酸化,长时间孵育抑制c-Met的磷酸化,同时以剂量依赖方式下调c-Met的表达。第三部分:DCN通过抑制c-Met对滋养细胞的作用及机制研究研究目的:为进一步探讨DCN通过抑制c-Met调控滋养细胞参与PE发生的具体机制,我们采用HTR-8细胞株做研究,通过构建敲降表达c-Met的sh RNA,并转染HTR-8细胞,干扰HTR-8细胞中c-Met的表达,同时应用c-Met抑制剂Crizotinib,检测 c-Met 下游效应因子（Akt、p-Akt、FAK、p-FAK、mTOR、p-mTOR）及相关自噬指标（p62、Beclin-1、LC3）,检测下调c-Met后滋养细胞生物学功能的变化,探讨DCN是否通过c-Met路径影响滋养细胞自噬和凋亡,参与PE的发生发展。研究方法:1.构建与验证sh c-Met慢病毒稳转细胞株。包装质粒将c-Met小分子干扰RNA（si c-Met）转染HTR-8细胞,干扰HTR-8细胞中的c-Met的表达。采用细胞免疫荧光、Western blot和Real time qRT-PCR检测并验证干扰效率。2.采用Western blot法检测不同处理分组后（空白组,加DCN组,滋养细胞干扰对照组对,c-Met干扰组,c-Met干扰+DCN组,c-Met抑制剂Crizotinib组,c-Met 抑制剂 Crizotinib+DCN 组）HTR-8 细胞 c-Met 下游蛋白（Akt、p-Akt、FAK、p-FAK、mTOR、p-mTOR）的表达。3.采用CCK8法、RTCA、细胞划痕迁移实验、Transwell、细胞凋亡检测实验和 Seahorse 能量测量仪测定不同处理后（CK、DCN、Crizotinib、Crizotinib+DCN、sh-Met、sh-Met+DCN）对滋养细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡及能量代谢的影响。4.采用Western blot检测不同处理组滋养细胞c-Met及p62、Beclin-1和LC3表达水平的变化。研究结果:1.c-Met干扰成功后,c-Met蛋白水平及mRNA水平均降低,sh-Met 1组构建成功并效果明显,后续采用sh-Met 1稳转株（sh-Met）做进一步实验。2.DCN通过抑制c-Met路径下调Akt、FAK和m-TOR的表达。3.下调c-Met活性后抑制HTR-8细胞的增殖、迁移和侵袭能力,且加快细胞凋亡的进程。4.DCN调控滋养细胞的有氧代谢和无氧糖酵解能力。5.下调c-Met活性后上调Beclin-1和LC3表达水平,p62则表现下降趋势。研究结论:1.DCN主要通过Akt/m-TOR通路,减弱c-Met活性发挥生物学效应。2.下调c-Met路径抑制HTR-8细胞的增殖、迁移和侵袭,并加快HTR-8细的凋亡与自噬。3.DCN通过抑制c-Met/Akt/mTOR途径诱导HTR-8细胞自噬和凋亡,调控PE的发生发展。