研究背景:子宫内膜异位症（EMS）的特点是子宫内膜样组织在子宫腔外种植,是雌激素依赖的具有恶性肿瘤行为的炎症性疾病,是造成女性慢性盆腔疼痛、痛经和不孕症最常见的原因之一,在育龄期妇女中的发病率约为10%-15%。虽然子宫内膜异位症的确切发病机制尚不清楚,但大量研究表明雌激素在其发生和维持中起着至关重要的作用。除了经典的雌激素基因组效应外,还有快速的非基因组信号效应,后者由一种G蛋白偶联雌激素受体（GPER）介导,与传统的雌激素受体（ER）一起调节对雌激素的生理效应。由此推测GPER的激活可能是导致子宫内膜异位症进展的机制之一。目前,在子宫内膜异位症病因研究中,对于雌激素受体的作用研究已经非常的成熟,但是关于新型雌激素受体GPER与子宫内膜异位症临床特征关系的研究却十分有限,既往的研究主要集中在异位症患者在位内膜及异位内膜组织中GPER蛋白及mRNA的表达情况,组织的获取是有创的且患者花费较高。本研究拟同时检测异位症患者血清中GPER的mRNA的表达情况,探讨其在子宫内膜异位症发病中的作用及预测价值。众所周知,miRNA是非编码单链RNA分子,仅由20-23个核苷酸序列组成。尽管长度有限,但是普遍存在于真核细胞的生物体内,在机体中发挥重要的作用。通过与靶基因mRNA的3’端非翻译区结合,直接诱导靶基因mRNA降解或抑制其蛋白质合成,从而参与调控细胞的多种功能。miR-148a作为miRNA中的一员,是近几年来研究比较广泛的具有明显抑癌效应的一个miRNA。miR-148a通过对靶基因的调控抑制肿瘤细胞的增殖凋亡、侵袭、转移等生物学特性,进而抑制肿瘤和耐药的发生,同时对恶性肿瘤的治疗及预后也有重要的参考价值。人类白细胞抗原-G（HLA-G）是HLAIb类抗原,是一种具有多种免疫调节作用的分子,HLA-G介导免疫细胞功能的抑制,被认为是肿瘤逃避免疫监视的重要机制。子宫内膜异位症病理形态上虽然属于良性病变,但也具有侵袭、粘附等类似恶性肿瘤的生物学行为。根据生物学信息显示,HLA-G3 UTR具有结合miR-148a的作用靶点,因此,miR-148a可以靶向调节HLA-G的表达。但miR-148a在子宫内膜异位症中的作用尚未见报道。miR-148a/HLA-G是否导致了异位内膜细胞增殖、凋亡、侵袭能力的改变,是否联合GPER共同参与了子宫内膜异位症的发生和进展,这些问题也鲜有报道,值得我们去进一步的探索。同样,以往的研究主要集中在异位症患者在位内膜及异位内膜组织中miRNA的表达。由于血液中miRNA具有稳定性强、特异性好、灵敏度高等特点,是理想的生物标记物。因此本研究首次研究血清中miR-148a表达情况,探讨其在子宫内膜异位症发病中的作用及预测价值。并通过体外细胞实验,验证在GPER的参与下,miR-148a/HLA-G通路在子宫内膜异位症发病中的作用。进一步通过研究大鼠子宫内膜异位模型,在体水平探究miR-148a对异位症组织的影响。以上也正是本课题的创新点。本课题的研究内容将从以下四个部分进行阐述:第一部分:GPER的表达与子宫内膜异位症临床特征的关系第二部分:miR-148a在子宫内膜异位症患者血清中的表达及临床意义第三部分:GPER/miR-148a介导子宫内膜异位细胞的凋亡第四部分:miR-148a对大鼠子宫内膜异位症的治疗作用第一部分:GPER的表达与子宫内膜异位症临床特征的关系目的:通过检测对照组和子宫内膜异位症患者组织中GPER蛋白及mRNA、血清中mRNA的表达,研究GPER表达与子宫内膜异位症临床特征的关系,探讨其对子宫内膜异位症的诊断及治疗的价值。方法:1.研究对象:共纳入93例子宫内膜异位症患者和82例正常女性对照者。子宫内膜异位症患者按照美国生育协会（ASRM）分期,其中Ⅰ-Ⅱ期40例,Ⅲ-Ⅳ期53例（其中15人在术前三个月给予醋酸亮丙瑞林（LA）3.75mg肌注,每28天注射一次,除此未应用其他激素类药物比如避孕药等,且在醋酸亮丙瑞林治疗期间,未行雌激素反向添加治疗。故Ⅲ-Ⅳ期异位症患者根据治疗情况进一步分为治疗组15人;其余38人未行醋酸亮丙瑞林治疗,为未治疗组）。2.应用免疫组织化学和Western blot方法检测GPER蛋白在正常对照组内膜及不同分期异位症患者的在位内膜以及异位内膜中的表达水平。3.实时定量PCR检测GPER mRNA在正常对照组和不同分期异位症患者血清中表达水平。结果:1.免疫组化及Western blot结果显示GPER蛋白在正常内膜组织、在位内膜及异位内膜中表达呈递增趋势,异位内膜及在位内膜中的表达均高于正常内膜（P<0.05）,同时异位内膜中的表达高于在位内膜（P<0.05）。2.组织中GPER mRNA表达情况:正常内膜、在位内膜以及异位内膜组织中的相对表达量亦呈递增趋势,两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）;血清中GPER mRNA表达情况:正常对照组低于异位症患者组并有统计学意义（P<0.05）。3.GPER蛋白在子宫内膜异位症Ⅲ-Ⅳ期患者中表达量高于Ⅰ-Ⅱ期患者,二者比较有显著性差异（P<0.05）。4.Ⅲ-Ⅳ期异位症患者中,治疗组的GPER在组织中的蛋白表达、mRNA表达及血清中mRNA表达均与未经治疗的患者相比较显著降低（P<0.05）。结论:1.GPER的表达与子宫内膜异位症的发病紧密相关,与疾病的分期有一定的相关性,可能参与了疾病的进程。2.GnRHa可降调GPER的表达。第二部分:miR-148a在子宫内膜异位症患者血清中的表达及临床意义目的:通过检测正常对照组及子宫内膜异位症患者血清中miR-148a的表达,探讨miR-148a与子宫内膜异位症的发病关系、临床特征及诊断价值。方法:1.应用实时荧光定量PCR方法检测子宫内膜异位症患者及正常对照人群的血清中miR-148a的表达水平。2.绘制miR-148a用于诊断子宫内膜异位症的ROC曲线,计算曲线下面积（area under the curve,AUC）以评估miR-148a对子宫内膜异位症诊断的准确性。结果:1.实时荧光定量PCR的结果显示,内异症患者及正常对照组血清中均检测出miR-148a的表达,而在内异症患者血清中miR-148a的相对表达量显著低于对照组（P<0.05）。2.miR-148a在Ⅰ-Ⅱ期内异症患者血清的表达高于Ⅲ-Ⅳ期内异症患者血清的表达,且两组之间存在统计学差异（P<0.05）。3.GraphPad Prism8.0绘制miR-148a检测对诊断内异症的ROC曲线,AUC值为0.91（优良）,且P<0.05,差异均有统计学意义。敏感度为76.8%,特异度为91.7%,置信区间为0.86-0.96。结论:1.miR-148a的表达参与了子宫内膜异位症的发病及疾病的进程,并且与疾病的分期有相关性。2.血清中miR-148a对内异症的诊断有一定的参考价值,或可成为子宫内膜异位症潜在的诊断标志物。第三部分:GPER/miR-148a介导的子宫内膜异位细胞的凋亡目的:通过体外实验,研究miR-148a对子宫内膜异位细胞行为的影响,进一步探索GPER/miR-148a通过HLA-G靶基因对子宫内膜异位细胞增殖及凋亡的影响。方法:1.子宫内膜异位细胞系Hs832.Tc细胞株中转染miR-148amimics、anti-miR-148a,分别用于上调和沉默miR-148a的表达,采用MTT法和流式细胞术分析miR-148a的过表达或沉默对Hs832.Tc细胞增殖和凋亡的影响。2.应用caspase-3和caspase-9活性检测试剂盒及Western blot方法检测miR-148a对Hs832.Tc细胞中caspase-3和caspase-9活性以及miR-148a的过表达或沉默对Bax/Bcl-2的表达影响。3.Western blot检测白细胞抗原G（HLA-G）的表达量。4.添加GPER的抑制剂G15,用于降低GPER蛋白的表达。采用实时定量PCR检测抑制GPER后对miR-148a表达影响。5.评估抑制GPER表达后,对miR-148a介导的Hs832.Tc细胞增殖、凋亡以及HLA-G蛋白表达量的影响。结果:1.MTT 实验表明,在 miR-148amimics 转染 12h、24h 和 48h 后,Hs832.Tc细胞的增殖速率较起始时均有所降低。在转染48h后,与阴性对照组相比,miR-148a的过表达显著抑制Hs832.Tc细胞的增殖（P<0.05）;而下调miR-148a表达则可以促进Hs832Tc细胞的增殖,呈时间依赖性,在转染48h后与对照组相比出现显著增加。2.流式细胞分析结果显示上调miR-148a表达在转染48h后可以显著诱导Hs832.Tc 细胞凋亡（P<0.05）,Hs832.Tc 细胞中 caspase-3 和 caspase-9 的活性显著增加。同时检测到Bax的表达量增加,而Bcl-2的表达量则减少,Hs832Tc细胞中Bax/Bcl-2的比率大幅度上升。下调miR-148a的表达量可以使Hs832.Tc细胞中caspase-3和caspase-9活性与阴性对照组相比显著降低,Bax/Bcl-2比值也显著降低。3.miR-148a过表达可以导致Hs832.Tc细胞中人类白细胞抗原G（HLA-G）表达量降低;而抑制miR-148a的表达又可以使HLA-G的表达水平较对照组增加。4.与未用G15处理的细胞相比,G15能够显著抑制Hs832.Tc细胞的GPER蛋白表达（P<0.05）。然而,与单独上调miR-148a组相比,在Hs832.Tc细胞加入G15后可以显着增加miR-148a在细胞中的表达。5.与单独上调miR-148a组相比,使用G15抑制GPER表达后,即下调GPER表达,可导致miR-148a过表达对Hs832.Tc细胞凋亡作用明显增强。6.下调GPER可以导致caspase-3、caspase-9以及Bax/Bcl-2比值增加的趋势更加明显,与单纯过表达miR-148a相比有显著差异。miR-148a过表达引起HLA-G蛋白的表达量显著下降,而下调GPER可以使HLA-G表达量进一步下降（P<0.05）。结论:1.miR-148a可以抑制子宫内膜异位细胞系增殖能力,促进细胞凋亡,同时抑制细胞系中HLA-G的表达。2.抑制GPER,增加了 miR-148a在细胞中的表达,增强miR-148a过表达对子宫内膜异位细胞系凋亡的作用。同时可以使HLA-G表达量进一步下降。3.GPER/miR-148a/HLA-G轴影响了异位内膜细胞的增殖、凋亡。第四部分:miR-148a对大鼠子宫内膜异位症治疗作用目的:基于上述研究,本部分拟通过在体水平研究miR-148a对SD大鼠子宫内膜异位模型异位囊肿的治疗作用。方法:1.采用自体移植的方法建立大鼠内异症模型,解剖鉴定,并测量建模成功后内异症囊肿的体积。选取未行建模手术10只作为假手术组;选取建模成功的SD大鼠27只,随机分为空白组（n=9）、阴性对照组（n=9）、miR-148a组（n=9）,每组分别经尾静脉注射30μL无菌双蒸水、30μLmimic NC混合物、30μL miR-148a mimic混合物,每隔3d给药1次,共4次。2.末次给药48h后麻醉大鼠并处死,剖腹探查,测量每组SD大鼠内异症模型异位囊肿的大小,比较各组异位囊肿体积的差异。3.取下假手术组的子宫内膜及建模成功大鼠的异位内膜组织,部分组织进行免疫组化和HE染色,在组织病理学水平比较各组的差异。4.Western blot及qPCR分别检测剩余组织中E-cadherin及N-cadherin蛋白表达水平及mRNA的表达水平。结果:1.手术建模4周后,剖腹探查,采用自体移植方法可以建立大鼠子宫内膜异位症模型,其建模成功率为90%。建模成功的大鼠随机分成三组（空白组、阴性对照组、miR-148a组）,给药前各组的异位囊肿体积差异无统计学意义（P>0.05）。2.给药处理后,空白组和阴性对照组异位囊肿的体积大小差异无统计学意义（P>0.05）,但miR-148a组与空白组和阴性对照组相比,其囊肿的体积显著变小,差异有统计学意义（P<0.05）。3.在组织病理水平检测发现,与假手术组相比,空白组、阴性对照组异位囊肿含有子宫内膜的腺体和间质细胞,固有层和周围的腺体样结构界限不明显,纤维化程度高;而miR-148a组的纤维化程度减弱,腺样体结构开始丰富,腺上皮细胞呈柱状或高柱状生长,朝向正常结构改善。4.免疫组化的结果显示E-cadherin在假手术组的子宫内膜中呈强阳性表达,阳性表达率为100%,而在各模型实验组异位内膜中呈弱阳性表达,阳性表达率分别为空白组53%、阴性对照组51%、miR-148a组75%,表达差异明显（P<0.05）;而经miR-148a药物治疗组的E-cadherin表达相对于空白组和阴性对照组有所升高（P<0.05）。N-cadherin在假手术组中主要呈弱阳性表达,阳性表达率为66%;在异位症模型中呈强阳性表达,分别为:空白组92%、阴性对照组90%、miR-148a组76%,与假手术组正常内膜比较有统计学差异（P<0.05）。而miR-148a组相对于空白组和阴性对照组的N-cadherin表达明显下调,并有统计学意义（P<0.05）。5.Western blot结果显示,E-cadherin在假手术组中高表达,与假手术组相比,内异症模型空白组、阴性对照组以及miR-148a组中的E-cadherin蛋白的表达水平明显降低（p<0.05）,而miR-148a组E-cadherin蛋白的表达又明显高于内异症模型空白组和阴性对照组（p<0.05）。N-cadherin蛋白的表达结果则与E-cadherin蛋白相反,N-cadherin蛋白在假手术组中表达较低,内异症模型空白组、阴性对照组以及miR-148a组中的表达水平明显高于假手术组（p<0.05）,而miR-148a组N-cadherin蛋白的表达又明显低于内异症模型空白组和阴性对照组（p<0.05）。6.qPCR结果显示:与假手术组相比,E-cadherin mRNA在内异症模型的空白组、阴性对照组及miR-148a组中的表达水平较低（p<0.05）;而miR-148a组较空白组和阴性对照组的表达高（p<0.05）。N-cadherin mRNA的表达趋势却相反,与假手术组相比,N-cadherinmRNA在内异症模型空白组、阴性对照组及miR-148a组中的表达水平高（p<0.05）;而miR-148a组低于空白组和阴性对照组（p<0.05）。qPCR的结果与Western Blot的结果趋势一致。结论:miR-148a可以促进子宫内膜异位症内膜细胞E-cadherin的表达、抑制N-cadherin的表达,促进间质上皮转化,抑制进而逆转异位症发展从而达到治疗作用。