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骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是一种全身性、系统性的骨骼疾病,其特征是骨量下降和骨微细结构破坏,表现为骨脆性增加,进而使骨折的危险性大大增加,即使是轻微的创伤或无外伤的情况下也容易发生骨折,然而目前还没有较理想的方法治疗骨质疏松。脉冲电磁场(Pulsed electromagnetic field,PEMFs)作为一种非侵入性治疗手段,被认为是安全有效的治疗骨质疏松症方法之一。本实验组前期已筛选出能够促进骨形成的脉冲电磁场各种参数,包括频率、强度、作用时间等。在这些参数条件下,脉冲电磁场显著提高了大鼠成骨细胞的成熟矿化,并能够提高去势大鼠的骨密度。然而,脉冲电磁场促进骨形成的作用机理尚不明确,是将电磁场应用于骨质疏松治疗的主要制约因素。本实验组前期研究表明,50 Hz 0.6 mT的低频脉冲电磁场是促进骨形成的最佳参数之一,在该参数条件下脉冲电磁场促进骨形成依赖于哺乳动物细胞表面的特殊细胞器——初级纤毛。鉴于上述结果,本论文开展了脉冲电磁场促进骨形成与初级纤毛及相关信号途径关系的研究。首先,为了考察低频脉冲电磁场能否促进骨形成,将体外分离培养的新生大鼠成骨细胞(Rat calvarial osteoblasts,ROBs)经PEMFs处理不同时间后,发现碱性磷酸酶活性显著升高,且成骨相关因子RUNX2、OSX、BMP-2基因和蛋白表达均发生明显变化,提示50 Hz 0.6 mT脉冲电磁场可促进骨形成。其次,为研究低频脉冲电磁场促骨形成与cAMP/PKA/CREB信号通路之间的关系,本实验用50 Hz 0.6 mT PEMFs处理大鼠颅骨成骨细胞不同时间后,胞内cAMP的含量迅速升高,且p-PKA、p-CREB蛋白表达量亦明显增加,并引起p-CREB发生核转位,提示促骨形成可能与cAMP/PKA/CREB信号通路相关。随后,再用腺苷酸环化酶(AC)抑制剂DDA和蛋白激酶A(PKA)抑制剂KT-5720分别对cAMP/PKA/CREB信号通路进行阻断,发现脉冲电磁场促进骨形成的能力被抑制。说明PEMFs在促进骨形成过程中,激活并依赖于cAMP/PKA/CREB信号通路。我们进一步检测了cAMP上游的腺苷酸环化酶十种异构体的表达,发现PEMFs处理后多种AC基因和蛋白表达量均明显升高,仅AC7在成骨细胞中不表达。再次,为了研究初级纤毛和cAMP/PKA/CREB信号通路是否存在联系,实验通过免疫荧光染色技术,对PKA、p-PKA及腺苷酸环化酶的10种异构体与初级纤毛共定位,结果发现p-PKA和可溶性腺苷酸环化酶(sAC)均定位于初级纤毛中。通过用sAC特异性阻断剂KH7处理成骨细胞后,发现cAMP/PKA/CREB信号通路被阻断,且促骨形成相关因子及钙化结节形成的能力均被抑制。最后,为了在动物体内进一步证明电磁场促进骨形成是否同样依赖于cAMP/PKA/CREB信号通路,实验用50 Hz 0.6 mT PEMFs处理SD大鼠后,血清中cAMP的含量明显升高,股骨蛋白中p-PKA、p-CREB、sAC蛋白表达量均明显增加。综上所述,50 Hz 0.6 mT PEMFs通过激活sAC/cAMP/PKA/CREB信号通路促进骨形成,而此过程依赖于初级纤毛内的sAC,为低频脉冲电磁场治疗骨质疏松提供了科学依据。