熔融堆积3D打印构建干细胞仿生支架修复软骨缺损的研究

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目的:研究以熔融堆积3D打印成型工艺制备的Ca CO3/PLA支架材料与生物组织体内的相容性;研究以熔融堆积3D打印Ca CO3/PLA材料为仿生支架与人脐血间充质干细胞共培养后,对新西兰大白兔膝关节全层软骨缺损的修复效果;探讨熔融堆积3D打印Ca CO3/PLA材料负载人脐血间充质干细胞对膝关节软骨缺损的修复机制。方法:使用熔融堆积生物3D打印机制备的材料,作为人脐血间充质干细胞的仿生支架材料,以Ca CO3/PLA作为打印浆料。打印完成后,对这种材料进行水热反应表面羟基磷灰石转化及表征检测,包括电镜扫描(SEM)打印的材料微观结构、能谱分析(EDS)其元素组成;选用人脐血间充质干细胞作为软骨组织工程细胞来源,采用密度梯度离心法结合差速贴壁法分离、筛选、制备人脐血间充质干细胞。并根据国际细胞治疗学会(ISCT)制定的标准,采用免疫荧光定性检测CD90分子、流式细胞仪定量检测CD34、CD45、HLA-DR、CD73、CD90、CD105分子表达情况,鉴定人脐血间充质干细胞。并进行3D打印材料负载干细胞共培养,CCK-8实验后酶标仪分析该材料对人脐血间充质干细胞生长是否有影响;采用外科方法建立兔膝关节软骨缺损模型后,实验分为4组,分别为对照组、人脐血间充质干细胞组、3D打印材料组及人脐血间充质干细胞+3D打印材料组,对各组进行不同干预后,8周后进行组织学苏木精-伊红、甲苯胺蓝、番红固绿染色,结合ICRS大体评分、改良Pineda评分、OARSI评分、II型胶原免疫组化检测透明样软骨生长情况以及MMP-13表达情况,评估各组膝关节软骨修复情况。结果:熔融堆积生物3D打印Ca CO3/PLA材料SEM检测,该材料呈三维疏松多孔结构,内部孔道相连续,孔径在580-800μm之间,EDS结果提示该材料C、O、Ca、P元素占所有元素的质量分数分别为50.3%、43.3%、2.8%、1.4%,说明该材料主要成分为Ca CO3;人脐血间充质干细胞经流式细胞仪检测,细胞标记物CD73、CD90、CD105分子高表达,表达率分别为94%、95%、96%;CD34、CD45、HLA-DR表达率均为0%,符合定义干细胞标准;组织学染色情况:与空白组相比,人脐血间充质干细胞组、3D打印材料组及人脐血间充质干细胞+3D打印材料组膝关节ICRS大体评分均明显升高,改良Pineda评分及OARSI评分明显降低,说明采取干预措施的三组可获得相应的修复(P<0.05);与人脐血间充质干细胞组和3D打印材料组相比,人脐血间充质干细胞+3D打印材料组除获得高ICRS大体评分、低改良pineda及OARSI评分外,免疫组化提示该组II型胶原表达增高、MMP-13表达降低,软骨细胞层修复效果优于人脐血间充质干细胞组和3D打印材料组(P<0.05)。结论:1.熔融堆积生物3D打印Ca CO3/PLA材料与兔膝关节具有良好的组织相容性及体内安全性;2.人脐血间充质干细胞+3D打印材料在软骨修复方面,效果优于单一使用人脐血间充质干细胞或3D打印材料;3.人脐血间充质干细胞+3D打印材料可通过提高II型胶原蛋白、降低MMP-13表达促进软骨修复。
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