周围神经损伤是种植手术中一种严重的并发症,神经损伤后患者会出现粘膜、颏部及下唇皮肤等不同程度的感觉功能障碍。雪旺细胞是周围神经中主要的胶质细胞,在周围神经损伤后的再生过程中发挥重要作用。如何促进雪旺细胞的增殖、迁移、分泌等一系列生物学行为,具有重要的研究意义。研究发现,某些生长因子如血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)具有促进雪旺细胞增殖、迁移等生物学行为的作用。但传统生长因子的临床应用面临很多问题,如提取步骤复杂、提取纯度不高、存在免疫排斥反应、体内稳定性低、需要反复局部注射来保证作用浓度,且单一的生长因子注射在模拟复杂体内环境上存在局限性,因而需要寻求一种更理想的生长因子治疗措施解决上述问题。浓缩生长因子(CGF)作为新一代的血小板浓缩物,内含多种生长因子如转化生长因子-β1(TGF-β1)、血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)、FGF、IGF和VEGF等,是一种可靠的生长因子来源。它取自患者自体静脉血,兼具采集方便、制作简单、成本低廉、无免疫排斥反应等优点。同时因为它内含大量血小板及生长因子,相比单一生长因子,可能提供一种更丰富的更能满足细胞生长需求的生理环境,这为其治疗周围神经损伤提供了可能。本实验利用体外实验研究了CGF对雪旺细胞增殖、神经营养因子分泌功能及迁移能力的影响,并探究了CGF促进雪旺细胞迁移的机制;利用体内试验研究了CGF对周围神经损伤后功能恢复及再生神经组织结构的影响,以期为临床应用CGF治疗种植术中神经损伤提供一定的理论基础。1.CGF的结构和生长因子释放规律本实验使用扫描电子显微镜观察CGF的超微结构,通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测CGF内TGF-β1的释放规律。扫描电镜观察显示CGF具有纤细的纤维结构,纤维相互交错,形成三维网状结构,其中可见大量中央凹陷呈扁圆形的红细胞和表面多突起的血小板。纤维平均直径为0.36±0.14μm,孔隙率为40.44±2.97%。ELISA检测显示CGF中TGF-β1的释放可以至少持续13天,在第1天时TGF-β1的释放浓度为75 pg/ml,随后逐渐增加,至第5天时达到高峰130 pg/ml,之后逐渐减少,至第13天时减少至60pg/ml。CGF的结构特点和生长因子持续释放能力为其成为良好的细胞支架和生长因子供体提供了基础。2.CGF对雪旺细胞增殖能力的影响本实验通过CCK-8实验及细胞周期分析检测了CGF对雪旺细胞增殖能力的影响。CCK-8结果显示,200%、100%、50%浓度的CGF条件培养液均可促进雪旺细胞增殖,其中100%的CGF条件培养液促进增殖效果最明显。因而,选择100%的CGF条件培养液作为最佳浓度进行后续实验。细胞周期分析结果显示,CGF条件培养液组的细胞增殖指数(PI)显著高于DMEM对照组,进一步证明了CGF对雪旺细胞的增殖具有促进作用。3.CGF对雪旺细胞神经营养分泌功能的影响本实验通过RT-q PCR和Western blot,分别从m RNA及蛋白水平检测了CGF对雪旺细胞分泌NGF和GDNF的影响。RT-q PCR结果显示,在第1、2、3天时,CGF组NGF及GDNF的m RNA表达水平均显著高于DMEM组(p<0.05):在各个检测时间点,CGF组NGF m RNA表达量分别是DMEM组的1.3、1.6、1.8倍,CGF组GDNF m RNA表达量分别是DMEM组的1.8、1.6、1.6倍。Werstern blot结果显示,CGF组NGF蛋白表达量在培养第2、3天显著增高,分别是DMEM组的1.1倍和1.5倍;CGF组GDNF蛋白表达量在培养第3天显著增高,是DMEM对照组的1.3倍。综上,CGF可以促进雪旺细胞的神经营养因子分泌功能。4.CGF对雪旺细胞迁移能力的影响及其机制本实验中采用细胞划痕实验观察CGF对雪旺细胞的迁移能力有无影响。雪旺细胞的迁移受多种信号通路的调节,其中整合素通路是重要调控通路之一,本实验采用Western blot检测整合素β1及其下游信号分子(p-FAK)的表达情况,以确定整合素β1信号通路是否参与了CGF介导的雪旺细胞迁移过程。利用RNA干扰技术,使整合素β1基因沉默,观察在整合素β1基因缺失状态下,CGF对雪旺细胞迁移作用的影响有无改变。划痕实验结果显示,CGF培养组的细胞迁移率是DMEM培养组的4.25倍,表明CGF可以促进雪旺细胞的迁移。Western blot结果显示CGF作用后雪旺细胞内整合素β1和p-FAK的表达水平升高,表明整合素β1信号通路参与了CGF诱导的雪旺细胞迁移过程。构建不同的si RNA质粒(si RNA-1、si RNA-2和si RNA-3)转染雪旺细胞后,RT-q PCR和Western blot结果显示,si RNA-2具有最佳的基因沉默效果:si RNA-2可使细胞整合素β1的m RNA表达水平降低70-80%,使其蛋白表达水平降低70%。整合素β1被si RNA-2沉默后,Transwell细胞迁移实验显示,CGF仍然可以促进雪旺细胞的迁移。综上,CGF可以促进雪旺细胞迁移,整合素β1信号通路参与了该过程。但CGF诱导的细胞迁移并非完全通过该信号通路,可能还存在其他分子作用途径。5.CGF促进周围神经再生的体内研究本实验建立了大鼠体内坐骨神经压迫损伤模型,利用足迹分析来观察CGF对神经损伤后功能恢复的影响,利甲苯胺蓝染色和透射电镜观察CGF对损伤后神经组织结构的影响。足迹分析实验显示CGF治疗后,其坐骨神经功能指数(SFI)显著高于对照组,表明CGF可以促进损伤后神经的功能恢复。甲苯胺蓝染色结果显示,神经损伤后其髓鞘发生变形,新生有髓神经纤维较少,而使用CGF治疗后,神经纤维髓鞘形状规则,并可见到大量新生的有髓神经纤维。透射电镜观察显示神经损伤后轴突与髓鞘内层分离,有髓神经纤维形状不规则,板层扭曲,排列不均;使用CGF治疗的有髓神经纤维排列比较整齐,板层无明显的扭曲,周围出现较多新生的有髓神经纤维,且雪旺细胞增殖明显。综上,CGF可以促进周围神经损伤后功能的恢复及组织结构的改善。