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本实验室前期研究表明新藤黄酸具有抑制黑色素瘤B16细胞增殖作用,其机制与诱导黑色素瘤B16细胞凋亡有关。本课题在前期研究的基础上,从调控细胞自噬角度进一步探讨新藤黄酸抑制B16细胞增殖的作用及可能机制,为将来将新藤黄酸开发成为临床有效的抗肿瘤药物或抗肿瘤增效剂提供一定的理论依据。1目的研究新藤黄酸通过调控细胞自噬抑制小鼠黑色素瘤B16细胞增殖的作用。2方法体外培养小鼠黑色素瘤B16细胞,采用MTT法检测新藤黄酸处理后细胞存活率;倒置显微镜观察B16细胞的形态变化;透射电镜观察新藤黄酸对B16细胞线粒体超微结构的影响;MDC染色观察细胞自噬泡的形成;流式细胞术检测新藤黄酸诱导B16细胞线粒体膜电位及ROS的改变;Western blot法检测LC-3、m TOR、AMPK及SIRT3相关蛋白的变化。3结果(1)MTT结果显示新藤黄酸明显抑制黑色素瘤B16细胞增殖,且随新藤黄酸浓度的增加和作用时间的延长,细胞存活率明显下降;(2)倒置显微镜下观察发现随着新藤黄酸浓度增加,与正常对照组相比,B16细胞的结构发生明显破坏,细胞出现空泡,或细胞破裂呈坏死状。(3)透射电镜观察发现新藤黄酸作用B16细胞后,细胞呈现明显的细胞自噬的形态学变化,线粒体数目明显减少,线粒体结构紊乱且多空泡化,部分空泡内可见内容物,并有部分线粒体被包裹进囊泡内;(4)MDC染色在荧光显微镜下观察可见,与正常对照组相比,新藤黄酸作用B16细胞后细胞内产生了自噬泡,新藤黄酸可诱导B16细胞发生自噬;(5)流式细胞仪检测结果显示,新藤黄酸处理B16细胞后,细胞内活性氧的含量随着新藤黄酸浓度的增大而增加,与未给药组比较具有显著性差异(P<0.01);线粒体膜电位也随之下降;(6)Western blot法检测表明AMPK及SIRT3蛋白表达随着新藤黄酸作用的时间延长而呈时间依赖性上升;LC3-I蛋白表达呈时间依赖性下降,而LC3-II蛋白表达量呈时间依赖性上升,LC3-II/LC3-I比值增大;m TOR蛋白的表达随着时间的延长有所下降。4结论新藤黄酸在一定时间和浓度范围内能够抑制黑色素瘤B16细胞的增殖,可能与诱导细胞发生自噬性死亡有关。其诱导细胞自噬的机制可能与调控ROS/SIRT3/AMPK信号通路相关联。