背景变应性鼻炎(allergic rhinitis, AR)是一种呈全球蔓延的鼻腔过敏性疾病,最新根据变应性鼻炎评分(Score for Allergic Rhinitic, SFAR)标准其发病率为31.6%,严重困扰着人们生活、学习和工作。变应性鼻炎发病涉及环境及遗传两个方面,近年提出了Thl/Th2免疫反应平衡障碍学说,即AR的发病主要是Th2型细胞免疫反应优势,通过介导多种炎症介质及细胞因子的释放,而导致一系列鼻过敏症状。因此,纠正以Th2型免疫反应过度为主而恢复Th1/Th2细胞免疫平衡的治疗方式成为重要的策略。T淋巴细胞来源于骨髓的淋巴样干细胞,按免疫效应功能可分为辅助性T细胞(Th)、细胞毒性T细胞(Tc/CTL)、调节性T细胞(Treg)、抑制性T细胞(Ts)等。Thl/Th2免疫反应失衡的调节和调节性T细胞(Treg)是目前世界范围内的两大研究热点。辅助性T细胞(Th)主要分为：Th1、Th2和Th17。Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF,参与细胞免疫及迟发型超敏反应的发生。抗原特异性Th2细胞在变应性免疫反应中通过释放大量的Th2型细胞因子(IL-4、5、6、10、13等)启动和维持炎症,其中IL-4和IL-13,它调节抗原特异性IgE的同型转换,IL-5可募集和激活嗜酸性粒细胞。Thl和Th2型细胞因子相互拮抗,选择性抑制Th2反应可能对防止变应性炎症至关重要。Treg细胞具有调节Thl／Th2平衡、抑制T淋巴细胞增殖和促进DC细胞成熟等作用。Treg细胞的免疫缺陷是近年来变应性疾病研究的重大发现之一,其中包括AR,已有研究表明变应性个体中存在变应原特异性Treg细胞数量和(或)功能的缺陷,并认为可能是AR免疫失衡的重要原因。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)属于中胚层的一类成纤维样多能干细胞,在人体骨髓、脂肪、脐带血等组织中都有其分布,具有自我更新、多向分化和再生修复实质组织器官的潜能。此外,因其还具有独特的低免疫原性和免疫调节作用使其成为干细胞研究领域的一颗新星。MSC可通过诱导细胞分裂阻滞来抑制T、B和DC细胞的增殖,还可抑制NK细胞的增殖和削弱DC细胞的成熟状态,以及抗原呈递。MSC依据靶器官中炎症微环境而实施有益的免疫调节,而无论是Th1免疫反应偏移还是Th2型免疫反应偏移。在变应性鼻炎及哮喘等Th2型免疫反应优势的变态反应疾病中,MSC可显著下调Th2型免疫反应而恢复Th1/Th2细胞免疫平衡,并可上调CD4+CD25+Treg细胞的比例。脂肪组织来源的MSC,即ADSC,与其他来源MSC一样具有独特的非特异性免疫调节作用。脂肪组织相比骨髓更丰富,且更易收获更多量成体干细胞。目前,AR治疗包括药物对症处理及特异性免疫治疗,药物对症处理仅对发作期患者起控制病情作用,维持时间短,停药复发,特异性免疫治疗因治疗患者群受变应原限制,治疗周期长,部分患者依从性差,或半途脱落而导致相当一部分患者放弃脱敏治疗。因而探寻新的治疗方式势在必行。初步的研究表明,ADSC对Thl／Th2免疫反应失衡及调节性T细胞具有复杂的调节作用。选择ADSC重新调整AR患者Thl／Th2细胞免疫平衡及Treg细胞治疗模式成为一项具有创新性的设计策略。因此,本研究在构建变应性鼻炎模型鼠的基础上探讨体外胶原酶消化合并贴壁筛选法分离培养的小鼠ADSC对模型鼠辅助性T细胞、调节性T细胞的调节作用及其机制。本研究的开展有可能将为今后AR临床治疗开辟一个崭新的领域奠定基础。研究目的探讨体外分离培养小鼠ADSC,并在构建变应性鼻炎模型鼠的基础上进一步探讨ADSC对模型鼠辅助性T细胞、Treg细胞的调节作用及其机制。材料及方法1实验材料及动物胰蛋白酶、DMEM/F12、胎牛血清、青-链霉素双抗、二甲亚砜(DMSO)、胶原酶Ⅰ型、间充质干细胞成脂/成骨/成软骨诱导分化培养基、Balb/c小鼠、卵清蛋白Ⅴ级、Ⅱ级、CM-Dil、Trizol、RT-PCR试剂、逆转录酶、DEPC、Mouse IL-4ELISA Kit、Mouse IL-6ELISA Kit、Mouse IL-10ELISA Kit、Mouse IFN-γELISA Kit。Balb/c小鼠[6-8周,雄性,体质量18-25g,由南方医科大学动物实验中心提供(合格证scxk粤2011-0015)。]2方法2.1ADSC的分离、培养取10只清洁级Balb/c小鼠,断颈处死,完全浸泡于75%酒精中约5分钟消毒,无菌取腹股沟处及附睾周围脂肪组织,剔除肉眼可见的小血管及结缔组织,含高浓度青霉素(300U/ml)+链霉素(300ng/ml)的PBS冲洗3次。眼科剪尽可能剪碎,加入2倍体积的0.1%的I型胶原酶,37℃水浴锅中震荡消化约30min,加入2倍体积的PBS液混匀,100目的筛网过滤,1200×g离心10min,移液器轻轻吸弃油性上清,沉淀用PBS洗涤3次,含10%胎牛血清的DMFM/F12培养基重悬,接种于25ml培养瓶中于37℃5%CO2孵箱中培养。24小时后首次换液,以去除残余的红细胞及未贴壁的细胞。以后每2-3天换液一次,细胞长满80%用胰酶消化传代培养。2.2流式检测ADSC的表面标记收集第3-5代ADSC约2×106个,1200×g离心4min弃上清。Buffer溶液重悬,吸取100μ1细胞悬液(约3.0×105个细胞)加入Ep管内。加入适量抗体,避光孵育30min。每样品管加入1.5～2ml Buffer溶液,1200×g离心4min弃上清。每样品管加入300μl Buffer溶液重悬后流式细胞仪检测。2.3ADSC或脂、成骨及成软骨诱导分化取生长状态良好的第3-5代ADSC,待细胞达到100%融合时,吸弃旧培养液。先加入2ml/孔的成脂诱导完全培养基A开始诱导,三天后更换为成脂诱导完全培养基B,24h后,再次更换为成脂诱导完全培养基A,如此进行2个循环。继续培养待胞内脂滴已较成熟时,对其进行油红0染色。取生长状态良好的第3-5代ADSC,待细胞达到70～80%融合时后,吸弃旧培养液,加入2ml／孔的成骨诱导分化完全培养基。每三天换液,直至可观察到明显钙结节。镜下观察见细胞钙结节变多,分化情况较恒定时,进行茜素红染色。取生长状态良好的第3-5代ADSC,消化离心弃上清,按7.5×105/m1加入软骨诱导基础液重悬细胞,1100×g离心5min;弃上清,按5.0×105/ml加入软骨诱导完全培养液重悬细胞；吸取500μl细胞悬液(即2.5×105个细胞)至15ml离心管中,1100×g离心5min;离心后不可摇动或吹打细胞团,拧松离心管盖,置于37℃,5%C02中孵育(24h内避免摇动细胞团)。每2～3天半量更换软骨分化诱导液,并轻弹使其脱离管壁悬浮。继续诱导培养待细胞团增大后,送做石蜡切片,进行甲苯胺蓝染色。2.4变应性鼻炎小鼠模型的建立、采用尾静脉注射ADSC处理模型鼠2.4.1致敏液和激发液的配制OVA致敏液：称取卵清蛋白V (OVA V)2mg,溶于4ml无菌PBS液中,常温下震荡溶解配成500ug/ml的OVA溶液：称取适量明矾(氢氧化铝),溶于适量无菌PBS液中,超声波下完全溶解配成10%的明矾溶液,取4ml明矾溶液加入OVA溶液中并充分混匀,用10N NaOH溶液调整PH至6.5,室温静置孵育60min,1200×g离心5min,吸弃上清,沉淀用无菌PBS液重悬至4ml,涡旋振荡器充分震荡摇匀。OVA激发液：称取卵清蛋白Ⅱ(OVA Ⅱ)40mg,溶于lml无菌PBS液中,使用前充分混匀。2.4.2致敏和激发Balb/c小鼠,60只,适应性饲养3d后完全随机分为6组(分组表示为：致敏/激发/处理),随机选组分别为实验组1(OVA/OVA/高剂量ADSC)、实验组2(OVA/OVA/低剂量ADSC)、实验组3(OVA/OVA/PBS)、实验组4(OVA/OVA/0)、对照组1(PBS/PBS/0)和对照组2(0/0/0)。实验组1-4和对照组1分别于第0、7、14天的相同时间,lml无菌注射器取现配的OVA致敏液和PBS液200ul/只(实验组1-4即100ug)进行基础致敏。第15-19d,每天相同时间以现配的OVA激发液(和PBS液)20ul(每侧鼻孔10ul,共800ug)进行滴鼻激发。滴鼻结束后立即观察双鼻流涕、挠鼻及喷嚏情况并记录(将其一次性连续多次抓鼻视为一次反应)。对照组2不做任何处理。2.4.3CM-Di1荧光探针标记ADSC取第3-5代长满约80%的ADSC, DPBS洗涤细胞,胰酶消化,重悬于DPBS液中并计数,每106个细胞加入500ul的2uM的CM-Dil,37℃孵育5min,4℃孵育15min, PBS洗涤3次,重悬于PBS中调整细胞密度分别为：高浓度ADSC液：3×107/ml和低浓度ADSC液：1×107/ml。2.4.4尾静脉注射ADSC处理模型鼠对致敏组1、2和3分别于致敏激发第20-22天,温盐水擦拭暴露鼠尾静脉后,1ml注射器分别抽取0.1ml的高浓度ADSC液(即高剂量ADSC)、低浓度ADSC液(即低剂量ADSC)和PBS液对相应的实验鼠进行尾静脉注射。2.4.5症状学分析：从造模第1天开始观察动物行为、形态、体征、摄食、饮水等,并于每次鼻腔激发后观察记录15min内鼻清涕、喷嚏及挠鼻次数,采用叠加量化计算总分,总分大于5分视为造模成功。2.5ELISA法检测血清中的IL-4、IL-6、IL-10及IFN-Y水平末次处理48小时后,1ml水合氯醛腹腔麻醉小鼠后摘眼球后立即收集外周血,室温静置2h后,1500×g离心10min。移液枪小心吸取上层血清采用小鼠ELISA试剂盒检测其中IL-4、IL-6、IL-10及IFN-γ水平,并进行统计学检验。2.6荧光定量PCR法检测脾脏组织中IL-4、IL-6、IL-10及IFN-γ的mRNA水平末次处理48小时后,1ml水合氯醛腹腔麻醉小鼠后摘眼球取外周血并处死,固定四肢后取脾脏,TRIZOL提取总RNA,取2ugRNA模板做逆转录反应,荧光定量PCR检测IL-4、IL-6、IL-10及IFN-Y基因表达情况。依据方法计算各组CT值,并进行统计学检验。2.7组织学分析末次处理48小时后处死小鼠,显微镜下取鼻腔呼吸区粘膜,10%的甲醛溶液固定,石蜡包埋,连续切片(约3um),进行常规HE染色,光镜下观察各组鼻粘膜中炎细胞的浸润情况。荧光显微镜绿色激发光下观察CM-Dil标记的ADSC在小鼠鼻粘膜(鼻粘膜白片)的迁移。2.8统计学分析应用SPSS13.0软件进行统计学处理,结果以X±s表示。多个样本均数比较采用单因素方差分析；Levene方差齐性检验,若方差不齐,用基于方差不齐的近似F检验Welch法；多重比较采用LSD(方差齐时)或Dunnett’sT3法(方差不齐时)。P<0.05为差异有显著性意义。结果1、小鼠ADSC的分离、培养接种24小时后,显微镜下可见少数细胞贴壁生长,形态不均一,呈短梭形、多角形,折光性较差。48小时后贴壁细胞明显增多,逐渐开始伸展,呈长梭形,有粗大突起,立体感增强。混杂生长细胞随换液及传代次数增加而明显减少。2、ADSC的表面标记鉴定流式细胞表面标志鉴定可见ADSC阳性表达CD44(31.60%),阴性表达CD106(4.98%)、CD34(10.46%)和CD45(12.43%)。3、ADSC成脂、成骨及成软骨分化成脂诱导培养3d后,显微镜下细胞立体感渐增强,继续培养细胞内小脂滴部分开始融合,约6d左右胞内脂滴数量渐增加,细胞由长梭形渐变为类圆形、多边形,油红0染色可见胞内大量脂质沉淀；成骨诱导培养诱导后细胞渐呈多角形,约10d后,胞质内可见大量颗粒,细胞呈集落样生长,细胞间可见钙质沉积；继续培养集落中心的细胞渐融合失去细胞结构,形成钙结节,经茜素红染色见红色结节；成软骨诱导培养后细胞团直径缓慢增大,表面渐光滑呈胶质,诱导20天左右后甲苯胺蓝染色呈淡蓝色。4、症状学评分：实验组1-4的40只鼠在鼻腔激发后的15min内,前5min小鼠即出现反复双前爪挠鼻、连续性喷嚏及多量清涕,后10min喷嚏间隙延长,挠鼻及清涕无明显变化,评分都大于5分,视为造模成功,其中8只出现阵发性挠耳、挠颈等症状。对照组1的10只鼠在致敏激发后的15min内,前5min小鼠均出现反复双前爪挠鼻,但连续性喷嚏及清涕不明显,评分小于或等于5。实验组1-4和对照组1、2比较,F=414.912,P=0.000,方差齐(P=0.280)进一步采用LSD法进行多重比较,实验组1-4的症状学评分较对照组1、2均具有显著差异(分别为P=0.000,P=0.000),对照组1与2间无显著性差异(P=0.483)。提示实验组1-4的症状学评分具有显著性差异。5、ELISA法检测血清中的IL-4、IL-6、IL-10及IFN-γ的水平按照ELISA试剂盒说明书操作,实验组1血清中IL-4和IL-6水平显著下降(与实验组4比较,P<0.05),IL-10和IFN-γ水平显著增加(与实验组4比较,P<0.05)；实验组2血清中IL-6水平显著下降(与实验组4比较,P<0.05),IL-10水平显著增加(与实验组4比较,P<0.05),IL-4和IFN-γ的水平无显著性变化(与实验组4比较,P>0.05),尽管二者分别具有降低和增加的趋势。这提示全身应用ADSC可影响AR模型鼠Th1、Th2及Treg细胞的分泌,进而调节机体Th1/Th2免疫状态和Treg细胞,并在一定程度上存在ADSC剂量依赖性。实验组4血清中IL-4和IL-6水平显著升高(与对照组2比较,P<0.05),IL-10和IFN-γ水平显著降低(与实验组4比较,P<0.05)。这提示本研究采用0VA+Alum方案成功构建了变应性鼻炎模型鼠,模型鼠存在Th1/Th2免疫失衡和Treg细胞功能缺陷。6、荧光定量PCR法检测脾脏组织的IL-4、IL-6、IL-10及IFN-Y mRNA的表达实验组1脾脏中IL-4和IL-6的mRNA水平显著下降(与实验组4比较,P<0.05),IL-10和IFN-γ的mRNA水平显著升高(与实验组4比较,P<0.05)；实验组2中IL-6的mRNA水平显著下降(与实验组4比较,P<0.05),IL-10的mRNA水平显著升高(与实验组4比较,P<0.05),IL-4和IFN-γ的mRNA水平无显著性变化(与实验组4比较,P>0.05).这提示全身应用ADSC可从基因水平影响AR模型鼠Th1、Th2及Treg细胞的分泌,进而调节机体Th1/Th2免疫状态和Treg细胞,并在一定程度上存在ADSC剂量依赖性。实验组4中IL-4和IL-6的mRNA水平显著升高(与对照组2比较,P<0.05),IL-10和IFN-γ的mRNA水平显著降低(与实验组4比较,P<0.05)。这提示本研究采用OVA+Alum方案成功构建了变应性鼻炎模型鼠,模型鼠在基因水平存在Th1/Th2免疫失衡和Treg细胞功能缺陷。7、CM-Dil标记的ADSC在鼻粘膜的迁移鼻粘膜切片在荧光显微镜绿色激发光下可见CM-Dil标记的ADSC呈红色荧光,可迁移至小鼠鼻粘膜,主要分布于鼻粘膜上皮层和上皮下层,实验组1(OVA/OVA/高剂量ADSC)明显多于实验组2(OVA/OVA/低剂量ADSC)。8、鼻粘膜组织学分析实验组4：嗜酸性粒细胞主要分布于粘膜固有层,并且基底膜增厚,间质水肿；实验组1、实验组2粘膜中无明显嗜酸性粒细胞浸润,基底膜增厚和间质水肿明显低于实验组4。结论1、Balb/c小鼠双侧腹股沟及附睾周围是脂肪组织良好的取材部位。采用胶原酶消化合并贴壁筛选法可分离获得ADSC。2、采用Balb/c小鼠以OVA+明矾可成功构建变应性鼻炎动物模型。采用CM-Dil成功标记小鼠ADSC。3、异体静脉移植的ADSC可向模型鼠鼻粘膜迁移,并发挥非特异性免疫调节效应,这部分是通过影响多种细胞因子的分泌进而调节Th1/Th2免疫失衡和Treg细胞的功能,且在一定程度上具有剂量依赖性。