论文部分内容阅读
目的:本文研究中药骨碎补、熟地体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的可行性,探索一种利用中药诱导骨髓间充质干细胞分化生成软骨细胞的方法。方法:(1)中药骨碎补、熟地用水提取,经减压浓缩,冷冻干燥至干,配制成骨碎补、熟地提取物。(2)通过密度梯度离心法和细胞贴壁法提取大鼠骨髓间充质干细胞,去除非贴壁细胞,细胞融合达到80%以上,胰酶消化传代,继续培养、增殖。(3)骨髓间充质干细胞传至三代后,将三代骨髓间充质干细胞加到96孔培养板中,每孔计数细胞数5000个。细胞贴壁后,分别加入不同浓度的骨碎补提取物、熟地提取物,一周后做MTT检测不同浓度药物作用下,骨髓间充质干细胞存活情况。(4)骨髓间充质干细胞传至三代后,将三代骨髓间充质干细胞接种在盖玻片上,细胞贴壁后,分别加入骨碎补提取物、熟地提取物,每2-3日换液,在体外诱导培养2周后,将爬满细胞的盖玻片取出,进行免疫细胞检测,检测Ⅱ型胶原的表达,评估软骨的形成。(5)将用骨碎补提取物、熟地提取物诱导分化后的细胞,与弹性软骨细胞做比较,进行免疫组化染色定量分析和统计学分析。结果:(1)加入骨碎补提取物后,光镜下见骨髓间充质干细胞由长梭形变为短梭形、多角形,部分细胞变圆,大部分细胞贴壁生长良好。体外诱导培养2周后,Ⅱ型胶原的免疫检测阳性。绝大多数细胞可见Ⅱ型胶原的表达,阳性信号主要位于细胞浆内,细胞与细胞之间的间充质内可见弱阳性信号的出现。(2)加入熟地提取物后,骨髓间充质干细胞的形态变化不大,仍然为梭形、多角形,细胞增殖较快,体外诱导培养2周后,Ⅱ型胶原的免疫检测阴性。(3)免疫染色定量分析和统计学分析显示:骨碎补诱导培养的细胞与阴性对照存在有差异。结论:(1)熟地提取物不可以促进Ⅱ型胶原的表达,熟地提取物不可以诱导骨髓间充质干细胞分化成软骨细胞。(2)骨碎补提取物可以促进Ⅱ型胶原的表达,骨碎补提取物可以诱导骨髓间充质干细胞分化成软骨细胞,(3)骨碎补作用于骨髓间充质干细胞的适合药量是0.02ug/5000个细胞。(4)中药骨碎补可以作为诱导剂,诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。