鸡球虫病是由几种艾美耳球虫寄生鸡肠道引起的一种严重的寄生虫病。目前,该病主要还是依赖于药物防治,抗球虫药物的广泛使用也加剧了球虫耐药性的产生。然而至今都没有找到球虫耐药性形成的机制,也没有找到控制球虫产生耐药性的靶基因。为了深入研究球虫耐药性产生的分子机制,我们实验室前期以柔嫩艾美耳球虫敏感株为基础分别诱导了对地克珠利和马杜拉霉素耐药的虫株,并利用转录组测序的方法对这两株耐药株以及柔嫩艾美耳球虫敏感株进行比较分析,成功获得了在敏感株和耐药株中差异表达的基因。本研究从差异表达基因中,选取了在两株耐药株中均显著上调表达的2个基因进行相关研究,这2个基因为柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(EtSTP)和ASNA1同源ATP酶(EtASNA1)。1.EtSTP和EtASNA1基因的克隆和表达以柔嫩艾美耳球虫敏感株cDNA第一链为模板,成功克隆了 EtSTP和EtASNA1基因,核苷酸序列分析表明,EtSTP的开放阅读框序列含528 bp,编码175个氨基酸残基,预测分子量为19.0 kDa;EtASNA1的开放阅读框序列含408 bp,编码135个氨基酸残基,预测分子量为14.6 kDa。分别将2个基因的ORF连接到原核表达载体pGEX-6p-l,成功构建了原核重组表达质粒pGEX-6p-EtSTP和pGEX-6p-EtASNA1,转化到大肠杆菌BL21感受态细胞后,用IPTG诱导表达获得了重组蛋白rEtSTP和rEtASNA1,2个蛋白均为包涵体表达。分别用纯化的重组蛋白免疫兔和小鼠,成功获得相应的多克隆抗体。2.EtSTP和EtASNA1在柔嫩艾美耳球虫中的功能特性分析利用实时荧光定量PCR和Western Blot,分析了EtSTP和EtASNA1在柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子的mRNA转录水平和蛋白表达水平,结果显示,EtSTP和EtASNA1均在未孢子化卵囊和第二代裂殖子阶段高表达,在子孢子阶段最低。利用间接免疫荧光定位,对EtSTP和EtASNA1在子孢子的分布进行分析,结果表明,EtSTP主要位于子孢子除折光体外的大部分区域,子孢子侵入鸡DF-1细胞后,EtSTP主要位于虫体的表面和带虫空泡膜上,且随着虫体的发育,EtSTP的荧光强度增强;EtASNA1在游离或侵入DF-1细胞的子孢子,均始终位于虫体的大部分区域。体外抑制试验显示,经兔anti-rEtSTP和anti-rEtASNA1抗体作用后,子孢子入侵细胞能力明显下降,在400μg/mL浓度下,anti-rEtSTP的抑制率可达32%,anti-rEtASNA1的抑制率为20%。3.EtSTP和EtASNA1基因在柔嫩艾美耳球虫敏感株与耐药株之间的差异分析利用透射电镜观察了敏感株和耐药株第二代裂殖子的超微结构,发现耐药株的淀粉颗粒明显增多。利用实时荧光定量PCR和Western Blot,分析EtSTP和EtASNA1在敏感株和地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株孢子化卵囊的转录与翻译水平,结果显示EtSTP和EtASNA1在2个耐药株中的表达量均远高于敏感株;利用实时荧光定量PCR分析田间分离的柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株和不同浓度地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株的mRNA转录水平,结果显示EtSTP和EtASNA1在野生耐药株的转录水平显著高于敏感株,而且在2个耐药株随耐药浓度的升高转录水平逐渐上升。此外,分析了敏感株和2个耐药株感染鸡与体外接种DF-1细胞后,在药物作用下EtSTP和EtASNA1表达量的变化,结果表明加入药物会引起其表达量上调。这些结果对深入研究球虫耐药机制及寻找药物靶点提供了一定的理论基础。