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嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是一种典型的人-兽-鱼共患病病原菌,该菌释放毒力因子的过程受群体感应(quorum sensing,QS)系统的调控,嗜水气单胞菌中存在着以酰基高丝氨酸内酯(AHL)为信号分子的感应通路和以呋喃酰硼酸二酯(AI-2)为信号分子的感应通路。已有文献报道,嗜水气单胞菌中群体感应调控因子AhyRI和LuxS对LitR具有调控作用,并且LitR与已报道的7个致病菌中群体感应调控因子保守序列高度相似,因此我们推测LitR是嗜水气单胞菌群体感应双通路的响应因子,有可能作为群体感应调控因子发挥作用。本文通过研究LitR表达与细菌浓度关系、litR基因缺失对毒力基因转录表达的影响、LitR与毒力基因的体外结合,旨在探究嗜水气单胞菌中LitR蛋白对毒力基因的调控机理。首先,构建用于LitR异源表达的重组菌Escherichia coli BL21(DE3)-pET28a-litR,IPTG诱导LitR蛋白表达,进而利用亲和层析和凝胶过滤层析纯化技术对LitR蛋白进行纯化,用纯化后的LitR蛋白制备多克隆抗体,以Gap-2为内参蛋白,利用western blot技术,分析LitR蛋白表达与菌体浓度的关系。结果显示,嗜水气单胞菌中LitR蛋白表达量与其生长呈正相关。其次,构建litR基因缺失自杀质粒pWM91-ΔlitR,将其转入供体菌E.coli SM10(λpir)感受态细胞,通过接合法将自杀质粒转入受体菌嗜水气单胞菌中,利用同源重组技术,将ΔlitR片段整合到基因组上,通过抗性筛选,测序证明成功构建litR基因缺失突变株。进而通过荧光定量PCR实验,研究LitR蛋白对溶血素、细胞毒性肠毒素;与运动有关的鞭毛蛋白;脂多糖合成蛋白等8个毒力基因的调控。结果显示,litR基因的敲除,导致2个毒力基因(溶血素、丝氨酸蛋白酶)转录水平下调;6个毒力基因(T6SS效应蛋白、胞外蛋白酶、细胞毒性肠毒素、两个鞭毛蛋白、脂多糖合成蛋白)转录水平上调。最后,利用softberry软件预测毒力基因的启动子区,PCR扩增启动子区,体外将LitR纯化蛋白与毒力基因启动子区结合,通过凝胶迁移实验分析LitR蛋白能否直接结合毒力基因的启动子区,DNase I足迹实验鉴定LitR蛋白与毒力基因的结合位点。结果表明,LitR能直接结合溶血素基因启动子区,且体外结合较强,共有4段结合区域,其中结合区I和II结合效果最强,结合序列分别为:TAATATATATTTTGCTAAATTAGAA和:TAAGTGATGAATGAAATAATG;LitR能直接结合丝氨酸蛋白酶启动子区,且体外结合较强,共有2段结合区域,结合序列分别为:TAATAGGTTGATCTACAAAGATAAATAT和:AGCCTTATCTCAGA;LitR能直接结合T6SS效应蛋白启动子区,且体外结合较强,共有1段结合区域,结合序列为:GGCAAGTTACG;LitR能直接结合细胞毒性肠毒素的启动子区;LitR与胞外蛋白酶启动子区体外结合较弱。