论文部分内容阅读
目的筛选与Wee1B激酶相互作用的新候选分子，证实该蛋白与蛋白激酶Wee1B的相互作用，为进一步探讨其对小鼠受精卵早期发育的影响奠定基础。方法1、以小鼠Wee1B编码基因的pcDNA3.1/V5-His-TOPO-Wee1B-WT野生型质粒为模板，设计特异性引物构建pGBKT7-Wee1B诱饵质粒。2、制备酵母感受态细胞，将诱饵质粒pGBKT7-Wee1B转入酵母感受态细胞中通过不同的培养板检测其对酵母的毒性、自身激活能力，再利用western blot检测其在酵母中的表达情况。3、将含有pGBKT7-Wee1B的酵母感受态细胞与人卵巢cDNA文库相融合，利用酵母双杂交系统筛选出阳性克隆，提取阳性克隆的酵母质粒转化大肠杆菌后进行测序鉴定，最终再经酵母重新转化验证。4、设计引物构建pcDNA3.1-flag-Wee1B与pcDNA3.1-Myc-KHDRBS3质粒，在HEK293细胞中应用免疫共沉淀验证筛选出的蛋白与Wee1B蛋白激酶的相互作用。5、在小鼠受精卵中应用免疫荧光共定位的方法验证筛选蛋白与Wee1B蛋白激酶的共定位情况。结果1、成功构建pGBKT7-Wee1B诱饵质粒。2、诱饵质粒pGBKT7-Wee1B对酵母感受态细胞无毒性，无自激活能力，通过western blot验证其在酵母感受态细胞中有表达。3、酵母双杂交系统从人卵巢cDNA文库中筛选出9个与Wee1B蛋白激酶存在相互作用的蛋白。4、免疫共沉淀证实蛋白激酶Wee1B与KHDRBS3蛋白在HEK293细胞中存在相互作用。5、免疫荧光共定位确定蛋白激酶Wee1B与KHDRBS3蛋白在小鼠受精卵中共定位。结论利用酵母双杂交系统从人卵巢cDNA文库中筛选出9个与Wee1B蛋白激酶相互作用的蛋白；免疫共沉淀证实KHDRBS3与Wee1B确实存在相互作用，且二者在小鼠1-细胞期受精卵中共定位。提示KHDRBS3蛋白可能通过与Wee1B相互作用进而参与调控小鼠受精卵的早期发育。