转基因鸡作为生物反应器因其世代间隔短,蛋白产量和糖基化程度高等卓越的优势成为生物科学领域的研究热点之一。禽类独特的生殖系统结构使得禽类转基因技术研究进程远远落后于哺乳动物,限制了转基因鸡生物反应器的研究进展。随着慢病毒载体的广泛应用和鸡原始生殖细胞培养技术的发展,已实现外源蛋白在家禽输卵管中高效、特异表达。血凝素（HA）蛋白是禽流感病毒（AIV）中最重要的保护性抗原,免疫原性强,基于HA蛋白的基因工程疫苗已表现出良好的免疫效果和应用前景。本研究以EGFP为报告基因,构建鸡卵清蛋白（Ovalbumin,OV）启动子真核表达载体,转染原代输卵管上皮细胞与CHO细胞,筛选得到1.1 kb的高效OV启动子。构建1.1 kb OV启动子表达H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白真核表达载体p OV_1.1k-HA,转染CHO细胞。PCR、RT-PCR鉴定结果证明HA基因整合至CHO细胞基因组,并进行转录;SDS-PAGE、Western blot及血凝试验结果证明HA蛋白在CHO细胞内的表达,并具有免疫反应性和血凝活性。以纯化的HA蛋白免疫4周龄SPF鸡,2周后加强免疫一次,加强免疫3周HI抗体水平为6.3log2;以10⁶EID50 H5N1（A/Goose/Guangdong/1/96）亚型禽流感病毒鼻腔接种SPF鸡,免疫组100%存活,喉拭子和泄殖腔拭子均未分离到病毒,对照组100%死亡。结果表明,筛选的1.1 kb OV启动子可有效驱动HA蛋白表达,表达的HA蛋白免疫SPF鸡对禽流感病毒攻击提供完全保护。为了建立表达HA蛋白的输卵管生物反应器,我们首先采用瞬时表达的方法分析OV启动子在鸡输卵管内的表达活性,将重组载体p OV_1.1k-HA经聚乙烯亚胺包裹后,经翅静脉注射产蛋高峰期母鸡,连续注射2天后收集所产鸡蛋,分离蛋清,通过Western blot分析,在70 KD处检测到HA蛋白条带,血凝试验结果证明HA蛋白具有血凝活性。结果表明,筛选的1.1 kb OV启动子可有效驱动HA蛋白在产蛋鸡输卵管中表达,为进一步获得转基因鸡输卵管生物反应器奠定基础。在成功建立输卵管瞬时表达模型的基础上,构建1.1 kb OV启动子表达HA的慢病毒载体,包装慢病毒,测定病毒滴度为9.8×10⁷ Tu/m L;利用赤道开窗法,将重组慢病毒注射到受精鸡胚的胚盘（X期）下腔,以获得转基因鸡。共注射鸡胚219枚,孵化得到出雏鸡39只,孵化率为17.8%。通过PCR鉴定,获得14只基因组中有HA基因整合的G0代鸡,转基因阳性率为35.8%。结果表明,利用慢病毒介导的基因转移技术成功获得整合HA基因的转基因鸡。本研究首先筛选到1.1 kb OV启动子,在细胞水平表达HA蛋白,纯化的HA蛋白免疫鸡后对禽流感病毒攻击提供100%保护。在成功建立瞬时表达模型的基础上,通过慢病毒介导的基因转移技术,获得整合HA基因的转基因鸡,为鸡输卵管生物反应器表达保护性抗原和珍贵药物蛋白的研究奠定了基础。