论文部分内容阅读
猪圆环病毒病是以猪圆环病毒2型(PCV2)为主要病原、继发或混合感染其他致病微生物的一系列疾病的总称，严重影响世界养猪业发展。目前普遍使用疫苗免疫进行控制，常用的疫苗主要有灭活疫苗和亚单位疫苗，其中用于灭活疫苗制备的细胞培养病毒滴度较低，疫苗制备成本较高;亚单位疫苗主要是大肠杆菌或昆虫细胞表达的病毒样颗粒，需用超速离心或层析方法纯化，工艺较复杂，成本也较高。 类弹性蛋白多肽(ELP)具有温度敏感的可逆相变特性，其融合蛋白可用简单的温控离心法纯化。自聚肽能在大肠杆菌内形成活性包涵体，其融合蛋白可用离心洗涤法纯化。细菌脂蛋白是重要的病原相关模式分子，通过Toll样受体2刺激先天性免疫细胞，释放的肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)、干扰素(IFN)等细胞因子具有免疫佐剂作用。本研究分别以ELP和自聚肽ELK16为纯化标签，用于PCV2Cap蛋白和脑膜炎奈瑟菌脂蛋白Ag473的融合表达和纯化，旨在简化PCV2亚单位疫苗生产工艺和研发新型细菌脂蛋白分子佐剂。 将自聚肽ELK16分别与脑膜炎奈瑟菌脂蛋白Ag473和PCV2Cap基因相融合，在重组大肠杆菌进行诱导表达。利用离心洗涤法进行分离纯化，获得的融合蛋白ELK16-Cap、ELK16-Ag473和ELK16-Ag473-Cap纯度分别为95％、94％和91％，产量分别为92mg/L、45mg/L和60mg/L细菌培养。将24只小鼠分为ELK16-Cap+IFA（弗氏不完全佐剂）免疫组、ELK16-Cap+ELK16-Ag473免疫组，ELK16-Ag473-Cap免疫组和PBS对照组。初免后7、14、21和28天采血，用ELISA检测PCV2特体抗体，结果在初免后7天，ELK16-Ag473+ELK16-Cap免疫组即为ELISA抗体检测阳性，其他三组为抗体检测阴性;从初免后14天，各免疫组抗体水平呈逐渐上升趋势，其中ELK16-Ag473+ELK16-Cap免疫组抗体水平最高，ELK16-Ag473-Cap免疫组抗体水平最低。在二免后两周采血，用试剂盒检测细胞因子表达。结果与PBS对照组相比，ELK16-Cap+IFA免疫组的血清TNF-α、IL-12和IFN-γ含量分别提高3.6、6.1和1.8倍，ELK16-Ag473-Cap免疫组的血清TNF-α、IL-12和IFN-γ含量分别提高4.9、8.8和7.7倍，ELK16-Ag473+ELK16-Cap免疫组的血清TNF-α、IL-12和IFN-γ含量分别提高2.6、8.3和9.6倍。这些研究结果表明，混合型和融合型Ag473均能有效刺激PCV2Cap蛋白ELISA抗体产生，其中混合型Ag473的刺激作用较强;混合型和融合型Ag473均能有效刺激小鼠产生IL-12和IFN-γ，其中混合型Ag473的刺激作用较强。 为了优化PCV2亚单位疫苗和比较纯化标签分子佐剂的影响，将His标签与PCV-2a、PCV-2d、PCV-2e中和抗原表位和PCV-2b Cap基因进行融合表达，用亲和层析法纯化4Cap-His融合蛋白。将ELP标签与Ag473基因进行融合表达，用相变循环纯化ELP-Ag473融合蛋白。将30只小鼠分为5组，分别为PBS对照组、4Cap-His免疫组、4Cap-His+ELP-Ag473免疫组组、4Cap-His+ELK16-Ag473组和4Cap-His+IFA免疫组。初免后7、14、21和28天采血，用ELISA测定Cap蛋白特异抗体。二免后14天取免疫小鼠脾细胞，用ConA或4Cap-His刺激后进行细胞因子浓度测定。每组三只免疫小鼠用103TCID50PCV2攻毒，第3和7天采血，用定量PCR测定病毒载量。结果显示初免后7天，4Cap-His+ELK16-Ag473和4Cap-His+ELP-Ag473免疫组即为ELISA抗体检测阳性，其他三组为抗体检测阴性;初免后14天，空白对照组和4Cap-His免疫组仍为抗体检测阴性，4Cap-His+IFA免疫组为抗体检测阳性，但显著低于4Cap-His+ELK16-Ag473和4Cap-His+ELP-Ag473免疫组;初免后21天，四个免疫组的抗体水平明显上升，其中4Cap-His+ELP-Ag473免疫组的抗体水平最高。与空白对照组相比，四个免疫组的TNF-α、IL-2和IFN-γ表达水平明显上升，但低于刀豆蛋白A刺激组。与空白对照组相比，四个免疫组的病毒载量均呈降低趋势，降低幅度依次是4Cap-His+ELK16-Ag473免疫组＞4Cap-His+ELP-Ag473免疫组＞4Cap-His+IFA免疫组＞4Cap-His免疫组。这些研究结果表明，ELP和ELK16标签对Ag473刺激PCV2ELISA抗体产生无明显影响，重组Ag473对小鼠体液和细胞免疫具有较强的刺激作用。