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干细胞作为一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞群体,其潜在的分化能力使其在细胞分化机制探究,疾病模型构建以及再生医学领域研究等方面具有广泛的应用前景。由于胚胎干细胞取材难,来源少,使用中有免疫排斥和伦理等问题,因此应用受到很大限制。诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,i PSCs）的发现极大地推动了干细胞领域的研究。目前,主要通过外源组成型表达Sox2,Oct4,c-Myc和Klf4四个转录因子,将小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast,MEF）或人包皮成纤维细胞重编程为i PSCs。但是,过表达外源基因将体细胞重编程为i PSCs的方法存在致瘤性和不可控性风险;仅使用小分子化合物诱导重编程过程效率低;使用抗生素作为诱导物调控激活内源基因表达,诱导重编程的方法也受限于药物调控系统扩散性和不可逆性的缺陷。如何从时间和空间上精确调控内源转录因子形成诱导性多能干细胞仍然是一个重要的问题。基于合成生物学理念,利用CRISPR/d Cas9基因编辑技术的内源基因精准靶向功能与光遗传学技术的时空特异性、可逆性和非侵入性的优势相结合,我们设计构建了一种光控CRISPR/d Cas9内源基因转录激活（Blue light inducible CRISRP/d Cas9 system for endogenous gene transcriptional activation,BICE）系统。通过光调控CRISPR/d Cas9基因转录激活系统靶向激活目标基因的表达,有望解决i PSCs在形成中出现的致瘤性、不可控性和效率低等问题。BICE系统由三部分组成:光控结合元件,目的基因转录激活复合物和靶向目标序列的d Cas9及sg RNA。光控结合元件由Tet R-CIBN和CRY2-VP64组成,其中CRY2和CIBN为隐花色素及其互作蛋白,均由PEF1α启动子起始转录表达。在蓝光照射下,CIBN与CRY2相互结合,复合物（Tet R-CIBN-CRY2-VP64）入核并通过Tet R与Tet O7的相互作用结合Ph CMVmin*-1启动子（Tet O7-h CMVmin）。目的基因转录激活复合物MCP-VPR（MCP-VP64-p65-RTA）由Ph CMVmin*-1启动并受VP64激活表达。受光调控表达产生的MCP-VPR经MCP与g RNA序列上MS2的相互作用结合至d Cas9,靶向并启动内源基因Sox2和Oct4的表达。为探究不同的系统元件对基因激活效率的影响,我们首先设计构建靶向Sox2和Oct4基因的多种g RNA组合和三种不同的转录激活复合物。通过比较不同组合激活内源基因表达的效率,我们发现由串联构建的g RNA与MCP-VPR转录激活复合物组成的BICE系统激活内源基因表达的效果较好。其次,我们对该系统进行基因表达动力学研究和可逆性研究。在BICE系统调控诱导MEF细胞重编程的过程中,q PCR结果显示在光照4天后Sox2和Oct4的表达明显上调,而且多能性基因Nano G,Esrrb,Fgf4和Nr5a2的表达量随着时间的延长也在增加,并于实验第21天上升至阳性i PSCs细胞系相似水平。通过免疫荧光染色我们发现在蓝光条件下形成的i PSCs显著表达多能性标记物Sox2,Oct4,SEEA-1,TRA-1-60,而黑暗组这些标记物均没有诱导表达。此外,原位形成的光控i PSCs的碱性磷酸酶（AP）染色结果呈阳性。转录组学分析结果也表明BICE系统调控MEF细胞重编程形成的BLi PSCs与阳性i PSCs细胞系具有相似的转录组表达谱。最后,为验证BICE系统调控形成的BLi PSCs具是否具有多向分化潜能,我们将原位形成的BLi PSCs注射入NOD/SCID小鼠皮下。小鼠体内形成的畸胎瘤经石蜡切片和HE染色处理后,显示有明显的三胚层组织结构,证明了光控形成的i PSCs具有向各个胚层分化的能力。综上所述,我们设计开发的BICE系统可以激活细胞内源基因表达并成功将MEF细胞重编程为i PSCs。这种光控方式解决了小分子类药物诱导重编程中药物扩散严重,诱导不可逆,对生理系统有负面影响等缺点,为诱导性多能干细胞的形成提供一种新思路和新策略,为再生医学研究和临床治疗提供一种新工具,具有潜在的临床转化意义。