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研究背景与研究目的:TRIM(tripartite motif-containing protein)家族蛋白是一类结构上高度保守的三基序蛋白,具有E3泛素连接酶的活性,广泛参与多种细胞生物学过程,如炎症免疫、神经发育、抗病毒、肿瘤发生等。TRIM65作为TRIM家族的重要成员,在肝癌、肺癌等恶性肿瘤的发生发展过程中发挥重要调控作用,但其在宫颈癌发生发展过程中的作用及机制尚未见报道。在本研究中,我们发现TRIM65在人宫颈癌组织中的表达明显高于癌旁组织,提示TIRM65可能通过泛素化作用降解相关重要抑癌基因而参与宫颈癌的发生发展进程。本课题拟在体外细胞水平上探讨TRIM65对宫颈癌细胞生长、迁移的影响,并阐明其可能的调控机制,从而为宫颈癌的防治提供新的作用靶点和实验依据。实验方法:1.TRIM65在人宫颈癌及其癌旁组织中的表达:通过免疫组化实验分析TRIM65在人宫颈癌组织和癌旁组织中的差异。2.TRIM65对人宫颈癌细胞增殖和迁移的影响:在人宫颈腺癌细胞(Hela)和鳞癌细胞(Siha)中敲低或过表达TRIM65,通过饱和密度实验、克隆集落形成实验、划痕实验和Transwell实验检测TRIM65对细胞生长和迁移的影响。3.TRIM65对细胞自噬、凋亡和周期的影响:利用免疫蛋白印迹实验检测自噬分子标志物LC3B和P62的蛋白表达情况;同时,通过免疫荧光实验观察自噬小体的数量,反应自噬流变化情况;转染特异性TRIM65 si RNA,进行流式细胞术检细胞凋亡和周期的变化。4.探讨可能的分子机制:(1)加入自噬抑制剂氯喹后,观察TRIM65 si RNA对细胞生长情况的变化,并检测TRIM65对自噬信号通路的影响。(2)在Hela细胞中,通过免疫共沉淀实验检测TRIM65与p53是否存在直接相互作用,进一步分析TRIM65影响宫颈癌的可能分子机制。实验结果:1.TRIM65在人宫颈癌组织中的表达明显高于癌旁组织。2.在宫颈癌细胞中,敲低TRIM65能有效抑制细胞的增殖和迁移。3.敲低TRIM65诱导自噬的发生,并影响自噬相关的信号通路,同时促进宫颈癌细胞的凋亡。4.Co-IP实验证明TRIM65与p53存在直接的相互作用。TRIM65是否可通过泛素化作用而降解p53还有待后续实验进一步验证。结论:TRIM65在人宫颈癌的发生发展过程中起重要作用,其机制可能与其促进宫颈癌细胞的增殖、迁移,以及促进自噬介导的细胞凋亡抑制作用有关。重要的是,我们证明TRIM65与p53存在直接的相互作用,但TRIM65是否是通过其泛素化机制降解P53,继而促进癌细胞增殖、迁移及抑制凋亡还有待进一步的实验加以证实。