慢性肝病已成为一个严重危害人类健康的世界性问题,而肝纤维化是一切慢性肝病的共同病理学基础。肝纤维化是肝脏对慢性损伤的一种修复反应,是持续性肝损伤的共有病理改变。肝细胞发生持续、反复的坏死或炎症刺激,大量纤维增生同时伴有纤维降解的相对或绝对不足,细胞外基质(ECM)在肝内大量沉积,正常肝细胞之间的血液微循环通道因纤维组织成分的沉积而造成循环障碍,影响肝细胞的血液供应,使因炎症受损的肝细胞不易修复甚至加重损伤,直至功能正常的肝细胞越来越少,最后导致肝硬化,甚至发展为肝癌。细胞珠蛋白(Cytoglobin,Cygb)是近年发现的含血红素辅基的六配位球蛋白,定位于大多数内脏组织的纤维样细胞的细胞质和细胞核中。像其他球蛋白家族成员(肌红蛋白、血红蛋白、脑红蛋白)一样,Cygb具有结合和运输氧的作用。越来越多的证据表明,Cygb在多种胁迫条件包括缺氧,氧化应激和纤维化刺激下表达上调,具有抗纤维化形成的作用。其一氧化氮双加氧酶和脂质过氧化物酶活性已被证实,但其分子机制并不清楚。从生理功能上看,Cygb是一种保护性蛋白。随着人类基因组计划的实施和推进,生命科学研究已进入后基因组时代,主要标志就是蛋白质组学的兴起。蛋白质组学是在大规模水平上研究组织或细胞内全部蛋白质的特征,包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、蛋白与蛋白相互作用等,由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生及细胞代谢等过程的整体而全面的认识。该研究是在本实验室前期已建立的大鼠肝纤维化的疾病模型和重组人源珠蛋白(rhCygb)治疗的基础上,通过优化后的双向电泳技术找出治疗前后对照组、模型组和治疗组之间肝脏和血清的差异表达蛋白,在蛋白质组学水平上对rhCygb的抗纤维化作用作出全面而整体的分析,并推测rhCygb抗肝纤维化作用的分子机制。课题主要分为四大部分的实验内容,第一步是用皮下注射CCl4法建立大鼠肝纤维化模型,实验将大鼠分成正常对照组、模型组和治疗组三组,通过检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肝脏纤维化四项指标包括层黏蛋白(LN)、透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原(pCⅢ)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)以及病理切片确定模型的构建成功。然后收集大鼠的肝脏和血清用于下一步分析;第二步是大鼠肝脏和血清双向电泳方法的建立和优化,并通过优化后的双向电泳技术对不同组别的大鼠肝脏和血清作出分析,在电泳图上找出不别组别之间差异表达的蛋白点;第三步是把双向电泳找出的差异蛋白点从双向电泳凝胶上切下,纯化后通过MALDI-TOF/MS进行质谱测定,将所得到的肽质量指纹图谱(PMF)上传至相应的蛋白质数据库搜索,确定差异蛋白;最后一步是对对照组、模型组和治疗组三组间差异表达蛋白的功能作出全面分析,并通过GO(Gene Ontology)分析富集差异蛋白的生物学功能,从而对rhCygb的抗纤维化作用机制作出预测。实验结果证实,模型组与对照组、治疗组各指标(谷丙转氨酶、谷草转氨酶以及肝纤维化四项指标)均有显著性差异(P<0.01),肝脏病理切片提示rhCygb对肝纤维有良好的逆转效果。经双向电泳发现血清中有43个差异的蛋白质点,经MALDI-TOF/MS鉴定出30个有意义的蛋白点,而肝脏中有50个差异蛋白点,经MALDI-TOF/MS鉴定出35个有意义的蛋白点。在这些差异蛋白点中,一些与肝纤维化正相关的蛋白分子在模型组特异性上调,如Nrap、Cathepsin D、FGFR1 oncogene partner 2 homolog、Clusterin、Haptoglobin、Hsp60、Asl、BACAT等。经过rhCygb治疗后,这些肝纤维化相关蛋白在治疗组中降低到了对照组的水平。而一些与肝纤维化负相关的分子包括参与氧化还原反应和肝脏生物转化作用相关的蛋白如 Peroxiredoxin-2、Nmrall、Glutathione S-transferase、Glutathione peroxidase 1、Cytochrome P450 在经过 Cygb 治疗后高表达。上述结果说明,我们成功构建了肝脏纤维化的动物模型,并且rhCygb在大鼠肝纤维化模型上取得良好的治疗效果。根据实验结果推测,Cygb可能是通过其本身的抗氧化作用和脂质过氧化物酶活性降低肝脏氧化应激压力、阻止肝星状细胞(HSC)被激活、减少炎症反应从而阻止纤维化的发生与发展。为重组人源细胞珠蛋白作为Ⅰ类候选新药的研发奠定理论基础。