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目的:本研究选取乳腺癌细胞系MCF-7,MDA-MB-231作为研究对象,加入不同浓度的大黄酚后,通过MTT实验、流式细胞术、western检测、实时荧光定量PCR等指标的变化,观察大黄酚对乳腺癌细胞增殖、细胞周期进程、细胞凋亡水平的影响,并分析大黄酚对NF-κB信号通路的作用,从分子水平阐明其作用的生物学机制。本文还观察了大黄酚对加入紫杉醇的乳腺癌细胞的影响,为临床应用传统中药治疗乳腺癌提供了理论依据,亦为解决临床肿瘤多抗药性的难题提供了新的思路。材料与方法:本试验选取乳腺癌细胞系MCF-7及MDA-MB-231（购于美国典型培养物保藏中心）作为实验对象,使用的培养基为包含10%胎牛血清的DMEM培养基。培养细胞时加入终浓度为0.01 mg/ml的合成胰岛素,孵育的条件为37℃,5%CO2。细胞接种于6孔培养板时的密度约为1×106 cells/ml。1.MTT实验筛选大黄酚作用浓度及时间细胞以5×103/孔的密度接种于96孔板中,过夜孵育。观察细胞贴壁后,更换无血清培养基继续培养24小时。细胞经终浓度为0、5、10、20、40、80μM大黄酚分别处理12、24、36、48小时后,每孔加入20μl浓度为5 mg/ml的MTT溶液,继续培养4小时。去除孔板中的上清液,并加入DMSO（150μl/孔）。在490 nm处检测其吸收峰值,该实验重复三次。计算细胞增值率,筛选大黄酚最适作用浓度及作用时间。2.流式细胞术分析细胞周期及凋亡水平细胞经过大黄酚处理24小时后用0.25%的胰蛋白酶进行消化收集。收集的细胞悬液用PBS缓冲液漂洗两次,并用250μl缓冲液重悬。用1%的多聚甲醛固定细胞24小时,然后用浓度为5 mg/ml的碘化丙啶染色,染色后的细胞用于细胞周期分析。收集的细胞经过碘化丙啶以及Annexin V/FITC染色后用于细胞凋亡水平分析。分析所用仪器为流式细胞仪。3.Western blot检测提取细胞总蛋白使用Pierce公司的细胞裂解液,并通过Bradford方法进行蛋白定量。聚丙烯酰氨凝胶电泳蛋白上样量为30μg,电泳完成后转印于PVDF膜上。本实验所用一抗为cleaved caspase 3,caspase 3,cleaved PARP,PARP,p-p65,p65,p-IκB,IκB,Bcl-2以及GAPDH,抗体孵育的条件为4℃,过夜。本实验所用二抗为山羊抗鼠或兔IgG,孵育条件为37℃,2小时。发光使用ECL发光试剂,凝胶成像仪为DNR BioImaging System。4.实时荧光定量PCR提取细胞总RNA使用Trizol试剂。反转录获取cDNA使用反转录仪以及PrimerScript RT Master Mix试剂盒。反转录溶液体系（20μl）,包含4μl 5X RT Master Mix试剂,800ng细胞总RNA,以及适量的无RNA酶水。反应过程为37℃,30分钟;85℃,2分钟。荧光定量PCR所用仪器为ABI 7500 Realtime PCR System以及SYBR Green master mix试剂盒。目的基因相对表达量的估测方法依据ΔCt=Ct gene–Ct reference。目的基因扩增倍数的估测是根据2-ΔΔCt方法。本实验内参基因使用GAPDH。本实验重复三次。统计分析所用软件为SPSS 19.0,进行单因素方差分析各实验组之间差异。P<0.05认为存在显著性差异,P<0.01认为存在极显著差异。结果:1.大黄酚抑制乳腺癌细胞增殖乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231经过不同浓度大黄酚处理并于不同作用时间后应用于MTT实验。结果显示,经过大黄酚处理后细胞的增值率降低,并具有浓度及时间依赖性。大黄酚浓度为5μM,时间12h时,抑制作用不显著。浓度增至10、20μM,时间增至24h,抑制作用明显增强。进一步增加浓度达到40μM,时间增至36h,细胞增值率降至50%以下,提示该浓度及作用时间已产生细胞毒性作用。2.大黄酚抑制乳腺癌细胞周期进程细胞周期结果显示,乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231经过大黄酚处理后处于G1期的细胞百分比增加,而处于S期的细胞百分比降低,处于G2期的细胞所占百分比未出现显著变化。提示大黄酚能够抑制乳腺癌细胞周期进程,使细胞周期停滞于G1-S节点。3.大黄酚调控乳腺癌细胞中周期相关基因的mRNA以及蛋白质的表达水平Western blot结果显示大黄酚下调乳腺癌细胞中cyclin D1和cyclin E蛋白表达量,上调p21蛋白表达量,并具有浓度依赖性。PCR结果与western blot结果一致,大黄酚下调乳腺癌细胞中cyclin D1和cyclin E mRNA水平,上调p21 mRNA水平,并具有浓度依赖性。4.大黄酚调控乳腺癌凋亡水平以及相关蛋白质表达水平乳腺癌细胞MCF-7以及MDA-MB-231首先经过大黄酚处理,然后经过Annexin V/PI双染进行凋亡水平分析。结果表明在两株乳腺癌细胞系中,大黄酚均能够显著上调细胞的凋亡水平。乳腺癌细胞系MCF-7以及MDA-MB-231分别经过紫杉醇（5nM,12小时）和大黄酚（20μM,24小时）处理,然后通过流式细胞术测定其凋亡水平。结果表明经过紫杉醇处理的MCF-7以及MDA-MB-231细胞中,western blot实验结果显示大黄酚能够显著上调细胞中cleaved caspase 3和cleaved PARP的表达水平。大黄酚能够促进经加入紫杉醇的乳腺癌细胞的发生凋亡。5.大黄酚通过NF-κB信号通路调控乳腺癌细胞的化学敏感性Western blot结果显示大黄酚显著下调乳腺癌细胞中Bcl-2,p-IκB以及p-p65的表达,表明大黄酚可抑制NF-κB信号通路活性。MCF-7和MDA-MB-231细胞经过NF-κB抑制剂PDTC处理,然后通过流式细胞术分析细胞的凋亡水平。结果显示加入紫杉醇的乳腺癌细胞在NF-κB信号通路活性受到PDTC抑制后,加入大黄酚组（紫杉醇+大黄酚+PDTC）和未加大黄酚组（紫杉醇+PDTC）之间细胞凋亡水平无显著差异。此外,在PDTC处理的乳腺癌细胞中,大黄酚对Bcl-2表达下调作用亦不显著。结论:1.大黄酚通过抑制NF-κB的磷酸化水平以及其下游cyclin D1、cyclin E的表达继而抑制乳腺癌细胞的恶性增殖以及细胞周期进程。2.大黄酚通过抑制NF-κB/Bcl-2信号通路促进乳腺癌细胞凋亡。3.大黄酚能够增加乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性,通过抑制NF-κB/Bcl-2信号通路促进加入紫杉醇的乳腺癌细胞凋亡。