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甲状旁腺素（PTH）是由甲状旁腺主细胞合成分泌的、调节钙磷代谢及骨转换的重要肽类激素。人体血液循环中存在三种PTH分子：PTH1-84、PTH37-84及少量PTH7-84,后两者称为PTH羧基端肽段（C-PTH）。研究发现,PTH1-34具有与PTH1-84完全相同的受体结合能力及促成骨作用,美国FDA已于2001年批准甲状旁腺素（1-34）肽（rhPTH1-34）用于治疗妇女绝经后骨质疏松症。但实验发现,当给予大鼠PTH1-34后骨肉瘤的发病率明显上升（最高致瘤率达52%）。近来发现,人体内存在C-PTH受体（CPTHR）, C-PTH与其特异性受体（非PTH受体）结合后可产生促细胞凋亡的生物学效应。因此我们推断PTH1-34的成骨-即抗成骨细胞凋亡作用可能诱发成瘤,而C-PTH的促凋亡作用可抑制PTH1-34的成瘤效应。该推断如果成立,将会对PTH在调节骨代谢方面作用的研究产生极其深远的影响。目的本研究拟从细胞实验和动物实验两方面,采用real-time PCR、western blot等实验技术和方法探讨PTH1-84、PTH37-84及PTH134对细胞周期的作用。已期阐明不同PTH分子对成骨细胞凋亡的不同作用,特别是人体内所含有的C-PTH分子即PTH37-84对成骨细胞细胞周期及细胞凋亡的影响,从而进一步证明C-PTH有促凋亡的作用,可能与抑制肿瘤的发生有关。方法1.培养原代成骨细胞：2日龄大鼠,采用酶交替消化法对成骨细胞进行分离。ALP染色、Von Kossa染色进行鉴定。2.进行药物干预：加入10"9 mol/L的PTH1-34,PTH37-84,PTH1-84,对照组加入等体积的PBS,培养24h后,收获细胞,分别提取总RNA和蛋白质。3.采用real-time PCR技术,2-ΔΔCT法在mRNA水平检测骨肉瘤相关凋亡基因：bax、bcl-2、caspase3、c-fos、cyclin Dl,并检测管家基因GAPDH作为内参照。SPSS 14.0统计软件处理试验数据,多组比较采用单因素方差分析,两两比较采用Student-Newman-Keuls检验。4.采用western blot技术,在蛋白质水平检测骨肉瘤相关凋亡蛋白（检测对象同上）,并检测管家基因GAPDH作为内参照。将曝光后X-ray照片用UVP凝胶成像分析系统进行扫描,计算各基因蛋白条带与内参GAPDH蛋白条带的光密度比值,推算各凋亡因子表达的变化趋势。5.构建动物模型：对于联合切除甲状腺及甲状旁腺的大鼠随机分成4组,分别给予40μg/Kg的PTH1-34、PTH37-84、PTH1-84及生理盐水,给药持续2个月,取骨组织分别提取总RNA和蛋白质。6.采用real-time PCR、western blot技术检测骨肉瘤相关凋亡基因在mRNA水平及蛋白质水平的表达。（同细胞实验部分）结果1.细胞实验部分：（1）原代成骨细胞的鉴定：原代成骨细胞经传代后,于显微镜下观察,细胞贴壁生长,形态以不规则形、长梭形、三角形为主,经ALP染色,说明细胞纯度较高。并采用Von Kossa染色,镜下见黑色的矿化结节,说明本实验分离得原代成骨细胞具有矿化功能。（2）PTH1-34对原代成骨细胞的作用：实验结果显示,给予10-9 mol/L的PTH1-34的原代成骨细胞,抑制细胞凋亡的基因（如bcl-2, caspase3, c-fos, cyclin Dl）与对照组相比,表达量明显增加；促进细胞凋亡的基因（如bax）与对照组相比,表达量明显降低。mRNA水平与蛋白质水平结果一致。（3）PTH37-84对原代成骨细胞的作用：实验结果显示,给予10"9 mol/L的PTH37-84的原代成骨细胞,促进细胞凋亡的基因（如bax）与对照组相比,表达量明显增加；抑制细胞凋亡的基因（如bcl-2, caspase3, c-fos, cyclin Dl）与对照组相比,表达量明显降低。mRNA水平与蛋白质水平结果一致。2.动物实验部分：（1）成功建立动物模型。（2）PTH1-34对大鼠成骨细胞的作用：给予40μg/Kg PTH1-34的大鼠检测结果与细胞实验一致,且mRNA水平与蛋白质水平结果一致。（3）PTH37-84对大鼠成骨细胞的作用：给予40μg/Kg PTH37-84的大鼠检测结果与细胞实验一致,且mRNA水平与蛋白质水平结果一致。结论1.我们成功培养了大鼠原代成骨细胞。细胞实验证实10-9 mol/L浓度的PTH1-34可能具有抑制大鼠原代成骨细胞凋亡的作用。1O-9 mol/L浓度的PTH37-84可能具有促进大鼠原代成骨细胞凋亡的作用。2.我们成功构建了去除甲状腺和甲状旁腺的动物模型。动物实验证实40μg/Kg的PTH134可能具有抑制大鼠成骨细胞凋亡的作用。而40μg/Kg的PTH37-84可能具有促进大鼠成骨细胞凋亡的作用。3.细胞实验和动物实验都初步证实PTH1-34可能具有抑制细胞凋亡的作用,而PTH37-84则具有促进细胞凋亡的作用。