【摘 要】
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摩氏摩根菌（Morganella morganii）属于摩根菌属,摩根菌属只有摩氏摩根菌一个种,是条件性致病菌。革兰氏阴性直杆菌,主要存在于呼吸道、泌尿道和直肠等,可导致伤口感染,腹泻,菌血症及败血症等,一些摩根氏菌毒力和耐药性不断地增加,导致其致病的死亡率不断增加。2018年我国首次报道在山东的荷斯坦犊牛发生摩根氏菌感染病例,导致57%死亡率,并表现出抑郁,食欲不振,瘫痪和白色絮状粪便等临床症状
【基金项目】
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山东省重点研发计划科技攻关项目,犊牛摩氏摩根菌病综合防控技术研究（2019GNC106141）；
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摩氏摩根菌（Morganella morganii）属于摩根菌属,摩根菌属只有摩氏摩根菌一个种,是条件性致病菌。革兰氏阴性直杆菌,主要存在于呼吸道、泌尿道和直肠等,可导致伤口感染,腹泻,菌血症及败血症等,一些摩根氏菌毒力和耐药性不断地增加,导致其致病的死亡率不断增加。2018年我国首次报道在山东的荷斯坦犊牛发生摩根氏菌感染病例,导致57%死亡率,并表现出抑郁,食欲不振,瘫痪和白色絮状粪便等临床症状。表明该病对奶牛养殖业存在巨大的威胁,为此,建立牛摩根氏菌抗原抗体检测方法,为牛摩根氏菌的早期诊断提供高效检测手段是非常必要的。本课题对从牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏中分离的SDTA-1、SDTA-2、SDTA-3、SDTA-4、SDTA-5五株菌,进行鉴定。分离出的细菌在普通的LB琼脂平板上是光滑,湿润和圆形的菌落,具有整齐的边缘。革兰氏染色镜检阴性、直杆状细菌。该菌发酵葡萄糖,甘露糖,苯丙氨酸,脲酶和鸟氨酸;不发酵鼠李糖,乳糖,蔗糖,麦芽糖,甘露醇,肌醇;VP呈阴性。药敏试验表示对丁胺卡那高度敏感,对头孢曲松和呋喃唑酮中等敏感,对恩诺沙星,环丙沙星和利福平有抗药性。16sr RNA分子鉴定方法测得的分离菌株序列与摩根氏菌序列同源性达99%,确定分离的菌株是摩根氏菌。鉴定出的摩根菌用于建立该细菌的检测方法,主要为摩根氏菌菌液直接PCR方法和间接ELISA方法。建立摩根氏菌PCR方法,在NCBI上选取登记号为MU9＿RS00145的摩根氏菌保守基因序列,设计特异性引物,以菌液为模板进行扩增,优化后确定PCR反应体系包括:PCR Mix 25μL,菌液5μL,引物F 1μL,引物R 1μL,dd H2O 18μL;引物的浓度为0.2μmol/L。PCR扩增的条件为:预变性:94℃、5 min;变性:94℃、30 s;退火:50℃、30 s;延伸:72℃、1 min 30 s;循环:循环32次;延伸:72℃、10 min。利用沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、金葡菌、大肠杆菌,巴氏杆菌验证,该方法具有较强的特异性,同时具有较高的重复性和灵敏度,检测灵敏度可达到0.2 CFU/μL。建立摩根氏菌间接ELISA方法以摩根氏菌LPP蛋白序列为目的片段,使用Nhe I酶和Eco R I酶进行质粒酶切,将目的片段插入到pc DNA3.1（+）载体质粒中,将构建的质粒转入感受态细胞中进行阳性质粒的筛选,再进行双酶切验证、测序验证。使用293T细胞进行真核表达,蛋白经镍柱纯化后运用SDS-PAGE、Western Blot方法验证。摩根氏菌全蛋白及菌体免疫小鼠,制备多抗并检测效价。用纯化后的重组LPP蛋白包被酶标板,建立ELISA方法并进行优化,所得结果如下:抗原最佳包被浓度2μg/m L,4℃作用12 h;封闭条件的选择是5%的脱脂奶、37℃作用1 h最为合适;血清的最适浓度为1:12800,最适作用时间为60 min;酶标二抗最适浓度是1:10000,最佳条件为37℃作用60 min,底物最适使用条件是室温作用45 min。随后根据统计学原理计算得出当血清OD450nm≥0.119判定为阳性,当OD450nm≤0.104时判定为阴性,二者之间为可疑。检测大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、金葡菌的阳性血清,除摩根氏菌外其他病原的血清均为阴性,表明本试验特异性良好,无交叉反应。同时对其重复稳定性进行测定,结果表明批内CV值在0.6%-13.2%,批间CV值在0.6%-10.3%,均小于15%,说明该方法重复稳定性良好。该课题建立了特异性检测抗原和抗体的方法,PCR方法针对抗原检测,特异性强、灵敏度高、简便快速、对标本的纯度要求低。ELISA方法针对抗体检测,特异性强、灵敏度高、易于操作,适用于临床大规模样品的检查。两种方法各存在自身优势,可根据实际情况选择,为摩根氏菌早期临床诊断奠定基础。
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