清营口服液抑制H1N1猪流感病毒复制作用的研究

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猪流感(Swine Influenza,SI)是由猪流感病毒(Swine Influenza Virus,SIV)引起的一种免疫抑制性疾病,临床上可以导致发热、急性呼吸道症状,发病率极高,并且容易继发猪繁殖与呼吸综合征、猪支原体肺炎等疾病,给养猪业带来了严重的经济损失。猪流感病毒作为病毒基因重组和新抗原亚型毒株产生的“混合器”,在整个流感病毒的生态分布和遗传进化中起着非常重要的作用。因此,为了全球畜牧业的稳定和发展、人类公共卫生的安全,加强对猪流感病毒的防控力度和监测手段有着非常重要的意义。当今用于防控猪流感的主要途径是对动物进行免疫接种和抗流感药物的使用,但由于流感病毒的特殊结构,其可通过高突变率与基因重排不断产生新的病毒亚型,使得目前疫苗免疫相对滞后。药物研发方面,主要包括M2离子通道阻滞剂和神经氨酸酶抑制剂,然而由于氨基酸的突变,耐药性越来越强。因此,迫切需要开发新的抗流感药物。本课题组对山东省的猪流感病毒进行监测时发现2020年的发病率和病死率均较往年有所升高,本人对泰安市某养猪场病死猪进行病毒的分离鉴定,明确其为H1N1 SIV感染,对该病毒进行分离纯化,并使用项目组自主研发的国家三类新兽药“清营口服液”对其进行体内外的综合抗病毒作用检测。清营口服液由清营汤改造,清营汤为清热剂,组方来自于我国中药古籍《温病条辨》,由犀牛角(水牛角代替)、生地黄、银花、连翘、玄参、丹参、麦冬、黄连、竹叶心组成,能够清热解毒,透热养阴,主治热入营分证,清营汤目前已被切实地用于临床治疗,在治疗乙型脑炎、流行性脑脊髓膜炎、败血症、肠伤寒或其他热性病证方面都有很好的效果,但在流感病毒的药效方面尚未有报道。因此,本课题采用上述分离到的猪流感病毒,利用小鼠(C57BL/6)和MDCK细胞作为模型,对清营口服液抑制猪流感病毒复制的效果进行了研究。主要包括以下方面:(1)体内实验:通过进行清营口服液最大剂量14天的小鼠灌胃药物实验,采血检测血常规和生化指标,判定该药物没有毒性;通过灌服清营口服液几天后,感染病毒,于感染后0、2、4、6天小鼠精神状况观察、体重测量、剖检后小鼠肺脏指数及HE染色等方法确定了清营口服液在小鼠体内对H1N1 SIV有明显的抑制效果。(2)体外实验:Reed Muench法计算了H1N1 SIV在MDCK细胞上的TCID50为10-3.66/100μL;利用q RT-PCR检测到清营口服液对H1N1 SIV有明显抑制作用,且吸附前期抑制效果最好,利用免疫荧光试验发现清营口服液能够有效抑制H1N1 SIV的NP蛋白核输出。同时检测了清营口服液对其他流感毒株(H9N2)的效果,同样发现该药物对H9N2具有很好的抑制作用。通过以上试验,初步明确了清营口服液对H1N1 SIV的抑制效果,可在临床使用中进行推广。
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