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研究背景：NB是儿童期最常见的颅外实体瘤，它不但恶性程度高、侵袭力强，而且早期转移率高、晚期病例多、治疗效果差。尤其是晚期高危病例，常因对一线药物不敏感导致耐药复发，长期生存率很低，是制约NB患儿生存率提高的主要原因。因此积极寻找有效的二线化疗药物是提高NB患儿生存率的重要手段。HCPT是我国利用天然资源优势研制出的纯天然生物碱抗肿瘤药，对多种肿瘤具有较好的疗效，且毒副作用较低、价格低廉。但其在小儿NB的治疗作用国内外尚未见报道。因此本研究通过体外实验结合临床治疗来探讨HCPT对NB的疗效，为探索NB新的、有效的化疗方案，提高生存率，提供理论基础与临床经验。第一部分羟基喜树碱对人神经母细胞瘤SMS-KCNR细胞增殖的影响目的：研究HCPT在体外对人NB细胞系SMS-KCNR细胞增殖和细胞周期的影响。方法：采用MTT法观察不同浓度的HCPT(2．5～200nM)作用不同时间(24h、48h、72h)后对SMS-KCNR细胞增殖的影响。同时应用平板集落形成试验观察不同浓度的HCPT(2．5nM、5nM、7．5nM、10nM、20nM)对SMS-KCNR细胞集落形成的影响。用不同浓度的HCPT(2．5nM、5nM、10nM、20nM)作用SMS-KCNR细胞24h及48h，碘化丙锭(PI)染色后用流式细胞仪检测并分析细胞周期的改变。结果：1．HCPT能显著抑制SMS-KCNR细胞增殖，并随药物浓度的升高和作用时间的延长而抑制作用增强，呈明显浓度和时间依赖性。2．在HCPT(2．5～200nM)作用24h及48h后SMS-KCNR细胞增殖抑制率分别为3．6～64．7%、12．5～91．7%，而2．5～20nM浓度范围HCPT作用72h的抑制率为36．7～97%。3．HCPT能明显抑制SMS-KCNR细胞集落形成，浓度为10nM和20nM时能完全抑制其集落形成。4．经流式细胞仪检测，不同浓度HCPT(2．5nM、5nM、10nM、20nM)作用SMS-KCNR细胞24h，使细胞周期阻滞于S期；作用48h使细胞周期阻滞于G2/M期。结论：HCPT能显著抑制SMS-KCNR细胞增殖和集落形成，其抑制作用呈时间和剂量依赖性。HCPT作用SMS-KCNR细胞24h及48h，分别使细胞周期阻滞于S期及G2/M期。第二部分羟基喜树碱对人神经母细胞瘤SMS-KCNR细胞凋亡的影响目的：研究HCPT在体外对人NB细胞系SMS-KCNR细胞凋亡的诱导作用，并探讨其诱导凋亡的信号转导机制，证实HCPT对SMS-KCNR增殖抑制作用是诱导细胞凋亡的结果。方法：用光学显微镜及DAPI染色荧光显微镜观察HCPT作用48h后SMS-KCNR细胞出现的凋亡形态学改变。用琼脂糖凝胶电泳检测DNA Ladder的形成。用流式细胞仪(Annexin V和PI双染法)检测细胞凋亡率的变化。采用Western blot检测不同浓度HCPT(2．5nM、5nM、10nM、20nM)作用SMS-KCNR细胞48h后线粒体凋亡途径中P53、Bcl-2、Bax、cytochrome c、caspase-3及PARP蛋白表达水平的变化。结果：1．不同浓度HCPT(2．5nM、5nM、10nM、20nM)作用SMS-KCNR细胞48h后能明显诱导细胞凋亡，凋亡的诱导作用呈剂量依赖性。2．光学显微镜显示不同浓度HCPT(2．5nM、5nM、10nM、20nM)作用SMS-KCNR细胞48h后使细胞密度呈剂量依赖性降低。DAPI染色荧光显微镜下观察到典型的凋亡小体形成。琼脂糖凝胶电泳检测到明显DNA梯形条带(DNA ladder)。3．流式细胞仪(AnnexinV和PI双染法)检测显示HCPT作用SMS-KCNR细胞48h后细胞凋亡率呈剂量依赖性增加。在2．5～20nM的HCPT作用48h后，早期凋亡细胞分别为12．22～50．78%，晚期凋亡细胞分别为8．67～67．32%，总凋亡细胞分别为20．89～97．66%，明显高于对照组(分别为4．15%、0．13%、4．28%)。4．HCPT(2．5～20nM)作用于SMS-KCNR细胞48h后，随作用浓度的增加，P53表达逐渐增高，呈显著的浓度依赖性。5．HCPT(2．5～20nM)作用于SMS-KCNR细胞48h后，Bcl-2、Bax表达水平、Bax/Bcl-2比值未见改变。6．HCPT(2．5～20nM)作用于SMS-KCNR细胞48h后，随作用浓度的增加，胞质cytochrome c表达逐渐增高，线粒体cytochrome c表达逐渐降低，呈显著的浓度依赖性。7．HCPT(2．5～20nM)作用于SMS-KCNR细胞48h后，caspase-3被激活，procaspase-3表达逐渐减少，有活性的17kDa亚基表达逐渐增加，呈显著的浓度依赖性。8．HCPT(2．5～20nM)作用于SMS-KCNR细胞48h后，PARP被激活，89kDa的裂解片段表达逐渐增加，呈显著的浓度依赖性。结论：HCPT能诱导SMS-KCNR细胞凋亡，凋亡的诱导作用呈显著剂量依赖性。HCPT通过P53介导的线粒体凋亡途径，诱导cytochrome c释放，并最终通过激活caspase-3及PARP促使细胞凋亡。HCPT有临床应用治疗NB的可行性。第三部分羟基喜树碱治疗复发和难治性神经母细胞瘤的疗效观察目的：复发和难治性NB疗效差，生存时间短，死亡率高。HCPT是纯天然生物碱抗肿瘤药，对多种肿瘤有较好疗效，但它在NB的治疗作用国内外尚未见报道。本部分在体外预实验的基础上应用HCPT治疗复发和难治性NB，探讨其疗效。方法：10例复发和2例难治性NB患儿接受HCPT化疗，其中5例复发患儿接受HCPT单药治疗，余7例患儿接受HCPT联合治疗。HCPT单药治疗用法：7．5mg/m~2，静脉滴注，d1～14；HCPT联合化疗采用改良新A1与改良B方案交替应用。改良新A1方案：CTX 1200mg/m~2 d1、VP16 100mg/m~2 d1～5、HCPT 5mg/m~2 d1～3、CDDP90mg/m~2 d4；改良B方案：IFO 1．5g/m~2 d1～5、HCPT5mg/m~2 d1～3、CBP450mg/m~2d2，均采用静脉滴注。结果：部分缓解4例(33．3%)，疾病稳定8例(66．7%)。有效患者中位缓解时间3．5(2～5)个月。HCPT单药治疗不良反应轻微，HCPT联合化疗的主要不良反应为骨髓抑制及消化道反应，无化疗相关的死亡。结论：HCPT治疗复发和难治性NB有一定的近期疗效，毒性可耐受，远期效果需进一步研究。