论文部分内容阅读
目的研究P[5]型猪C组轮状病毒(group C rotaviruses,RVCs)Por2011 GST-VP8~*蛋白的受体结合特征并推测其受体结合位点,为阐明RVCs在猪中的传播机制提供了一定的基础;研究人G6P[8]型A组轮状病毒(group A rotaviruses,RVAs)Rotateq VP8~*蛋白的受体结合特征,解析P[8]型Rotateq VP8~*蛋白与受体复合物的结构并阐明其受体结合机制;研究RVAs牛G1P[5]型VP8~*蛋白的受体结合特征并解析P[5]型VP8~*蛋白的结构,为探究P[5]型RVA与宿主相互作用的机制提供一定的基础。方法(1)从Gen Bank数据库中检索G6P[5]型Por2011的VP8~*基因序列,将其构建于质粒p GEX4T-1载体;表达并利用GST标签纯化Por2011GST-VP8~*蛋白;通过功能实验研究并验证其受体结合特征;序列比对和突变分析确定其潜在受体结合位点。(2)从Gen Bank数据库中获取G6P[8]毒株Rotateq P[8]的VP8~*基因序列进行基因合成,分别构建于表达载体p GEX-4T-1和p ET-30a上,表达GST-VP8~*重组蛋白和His标签的VP8~*蛋白并通过亲和层析、凝胶过滤层析法对蛋白进行纯化,同时表达并纯化P[8]BEL、P[8]Lab、P[4]、P[6]GST标签的VP8~*蛋白;通过功能试验研究Rotateq P[8]GST-VP8~*蛋白的受体结合特征;采用坐滴气相扩散法进行人Rotateq P[8]VP8~*蛋白晶体生长筛选,与糖进行共结晶,通过X晶体衍射法收集晶体数据,并将P[8]VP8~*蛋白的糖结合位点与P[4]、P[6]和P[19]VP8~*蛋白的结合位点进行比较。(3)从Gen Bank数据库中获取G1P[5]毒株的VP8~*基因序列,构建于表达载体p GEX-4T-1和p ET-30a上,通过原核表达系统分别表达GST-VP8~*蛋白和带His标签的VP8~*蛋白并进行纯化;利用寡糖结合实验和生物分子相互作用检测研究P[5]GST-VP8~*蛋白与寡糖结合的特性;采用坐滴气相扩散法进行牛P[5]VP8~*蛋白晶体生长筛选,并通过X晶体衍射法解析P[5]VP8~*蛋白的天然晶体结构。结果(1)成功表达并纯化Por2011 GST-VP8~*蛋白;功能试验显示Por2011 VP8~*蛋白与含有P1抗原(Galα1-4Galβ1-4Glc Nacβ)的糖具有很好的结合;对第107位氨基酸进行点突变后的VP8~*蛋白与P1抗原有较明显的结合。(2)成功表达并纯化Rotateq P[8]VP8~*蛋白和P[8]BEL、P[8]Lab、P[4]、P[6]GST标签的VP8~*及His标签的Rotateq P[8]VP8~*蛋白;功能实验显示P[8]VP8~*蛋白与粘蛋白核心mucin core2和H1抗原具有良好的结合;复合物结构解析发现VP8~*蛋白的W81、L167、Y169、G170、G171、R172、W174、T185、R209和E212残基组成糖结合位点,参与了与core2的相互作用,LNFP1与VP8~*蛋白的结合位点与core2的结合位点相同。(3)成功表达并纯化P[5]GST-VP8~*蛋白和VP8~*-His蛋白;功能实验显示P[5]GST-VP8~*蛋白与唾液酸糖有很好的结合;结构解析发现P[5]VP8~*具有典型的半乳糖凝素样结构,且与人P[8]VP8~*蛋白的结构最接近。结论(1)猪RVCs的某些型别可能以P1抗原为潜在受体,该受体结合位点与人RVCs的受体结合位点较为接近,这为研究猪RVCs的感染机制提供了一定的依据和基础。(2)粘蛋白核心mucin core2和H1抗原是P[8]型RVA的重要细胞黏附因子;P[8]VP8~*与P[4]、P[6]和P[19]的VP8~*蛋白具有相同的糖结合位点。(3)牛G1P[5]型RV可以与多种含有唾液酸的糖相互作用,并可能通过唾液酸感染宿主细胞;P[5]型RVs VP8~*蛋白的晶体结构最接近P[8]VP8~*,但与结合唾液酸的P[3]/P[7]VP8~*蛋白的晶体结构差异较大,且唾液酸结合位点的氨基酸也有很大不同,因此推断P[5]可能通过不同的机制或结合位点与唾液酸结合。