论文部分内容阅读
目的：研究GTP酶激活蛋白-Src同源结构域3-结合蛋白1[GTPase activating protein-(Src homology domain3)-binding protein1, G3BP1]是否参与了人乳腺癌细胞系MDA-MB-231及人非小细胞肺癌细胞系A549的体外迁移过程,并在结果为阳性的前提下尝试提出可能的理论机制。方法：一：免疫印迹法检测MDA-MB-231中G3BP1表达水平是否与文献报道一致；向MDA-MB-231细胞内转染以G3BP1的mRNA为靶点的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)以抑制G3BP1的表达；趋化实验检测抑制G3BP1表达后MDA-MB-231细胞穿过10gm聚碳酸酯膜的数量；lOng/ml表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)分别刺激30s、1min、2min以及5min时MDA-MB-231细胞内G3BP1, PKCζ, Akt, pPKCζThr410/403和PAktSer473的表达情况。免疫共沉淀法检测MDA-MB-231内G3BP1是否与PKCζ存在相互作用。二：以MDA-MB-231为阳性对照,免疫印迹法检测A549内G3BP1的表达情况；A549细胞内转染以G3BP1的mRNA为靶点的siRNA以抑制G3BP1的表达；趋化实验、体外侵袭实验及划痕实验分别检测A549细胞穿过8μm聚碳酸酯膜、人工基底膜(matrigel)的数量,以及在无外源趋化诱导物刺激情况下定向运动距离。最后,免疫印迹法检测G3BP1在另外3种肺癌细胞系GLC-82、H1299以及NCI-H358中的表达情况。结果：一：经免疫印迹法检测,G3BP1在乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞中表达异常升高,与文献报道一致；转染siRNA后经免疫印迹法检测MDA-MB-231细胞内的G3BP1表达被完全抑制；趋化实验、划痕实验分别显示在内源性G3BP1表达被抑制的情况下,MDA-MB-231细胞在体外穿过8μm聚碳酸酯膜的数量、无外源趋化诱导物刺激情况下定向运动距离均比G3BP1未被抑制的MDA-MB-231细胞显著下降(P<0.05)；10ng/mlEGF分别刺激30s、1mmin、2min以及5min, MDA-MB-231细胞内G3BP1,蛋白激酶Cζ (protein kinase Cζ,PKCζ)与蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)表达水平几乎无变化,pPKCζThr410/403、 PAktSer473及pAkt表达水平随外源EGF刺激时间延长而逐渐增加,至5min时达到峰值。MDA-MB-231细胞内G3BP1与PKCζ存在相互作用。二：经免疫印迹法检测,G3BP1在A549中的表达水平与其在MDA-MB-231中非常接近,故可以推测其在A549中表达同样异常升高；转染siRNA后经免疫印迹法检测A549细胞内的G3BP1表达被完全抑制；趋化实验、体外侵袭实验以及划痕实验分别显示在内源性G3BP1表达被抑制的情况下,A549细胞穿过8μm聚碳酸酯膜、人工基底膜的数量、无外源趋化诱导物刺激情况下定向运动距离以及在体外穿过人工基底膜的细胞数量均比未被抑制G3BP1表达的A549细胞显著下降(P<0.05)。最后,免疫印迹法检测在GLC-82、H1299以及NCI-H358细胞中,G3BP1的表达水平并不一致,具体表现为G3BP1在GLC-82以及H1299中表达水平升高,而在NCI-H358中表达水平降低。结论：G3BP1在人乳腺癌细胞系MDA-MB-231中表达水平异常升高,而其表达被抑制后MDA-MB-231的趋化以及定向运动能力均显著下降,表明G3BP1很有可能参与了乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移过程,并在该过程中发挥重要作用。由于PKCζ及其信号通路下游分子Akt的磷酸化水平随外源趋化因子刺激时间增加而增加,且G3BP1与PKCζ存在相互作用,故推测G3BP1可能通过PKCζ-Akt信号通路参与了MDA-MB-231的迁移过程。G3BP1在人非小细胞肺癌A549中表达水平同样升高,且其表达被抑制后A5491的趋化、体外侵袭以及定向运动能力均显著下降,表明G3BP1同样很有可能参与了非小细胞肺癌A549的迁移过程,并在该过程中发挥作用。但由于G3BP1并非在所有肺癌细胞系中均过表达,故G3BP1是否在所有癌细胞迁移过程中均发挥作用需要进一步研究。