据统计，因为毒性原因遭淘汰的药物占侯选药物的50%，其中约有30%的新药是在中后期开发过程中因安全性问题被淘汰。因此，迫切需要发展新药研制早期毒性筛选方法，以降低药物在临床前试验中因毒性的淘汰率。目前体外细胞培养方法通常采用一种细胞，只能评价受试物对该细胞的特定作用，而受试物在体内具有器官选择性；其次多数物质在体内需经肝脏或其他代谢器官进行代谢解毒或活化，而单一细胞只能采用体外活化系统S9模拟体内的代谢情况；第三，在未知毒性靶器官时盲目采用某一器官细胞进行毒性测试其预测价值就非常有限。为此，本实验室发展了大鼠体外多器官细胞共培养模型，该模型能覆盖多个主要靶器官，初步验证其具有较好的靶向性，在作为靶器官毒性筛选上有良好的发展前景。但该模型多器官细胞采用飞片法在培养板中共培养，存在通量低、操作复杂、所需受试物和培养基较多等问题，另外原模型中缺少神经系统这一重要的毒物作用器官细胞，需要针对这些问题进一步加以改进。过去十年，环境研究的焦点部分已从常规优先污染物转向新兴（型）污染物。如在环境和食品中广泛检出抗生素等药物，有的甚至发生人和动物中毒。由于这些药物暴露途径和方式不完全与临床相同，需要研究其潜在的其它可能毒性。由于纳米材料特殊的物理、化学和生物学特性，其安全性引起了人们的广泛关注。本课题拟在对大鼠多器官细胞共培养模型进一步改进和验证的基础上，通过对几种常用的抗生素和抗肿瘤药物进行测试，进一步揭示这几种药物的潜在毒性；通过比较研究具有不同尺度的纳米二氧化钛（Nano-TiO2），纳米二氧化硅（Nano-SiO2）和纳米氧化锌（Nano-ZnO）三种纳米物质对代表多种器官的细胞的毒性及其特征，进一步研究其靶器官特征，探讨大鼠多器官原代细胞共培养方法是否可作为初筛纳米物质靶向性或研究其毒作用特征的模型，为其安全性评价提供依据。同时，也为进一步改进此模型提供依据。方法1、大鼠多器官原代细胞共培养模型采用代表五种主要靶器官的原代细胞进行非接触式共培养，包括原代肝细胞，神经星形胶质细胞，肺泡巨噬细胞，心肌细胞和肾皮质细胞。采用自己改制的共培养细胞板，即将48孔培养板，以每6个孔为一单元，在每两孔之间的壁下端打一孔，使6孔间培养基能相互连通。每种细胞先单独分别接种于每个单元的6个孔中培养，另外设立一个阴性对照孔（即不接种任何细胞）。待各细胞贴壁后，加入较多的培养基使6个孔相互连通，在同一培养基、同一受试物浓度和相同的培养条件下共培养五种器官的细胞，此即为48孔板大鼠多器官原代细胞共培养的模型。通过MTT比色法比较共培养和单培养条件下五种细胞在7天内的生长增殖情况。通过已确定靶器官的毒性物质百草枯、四氯化碳作用于此模型，观察24h后两种物质对该模型中各细胞的毒作用特点，来验证此模型是否可以作为靶器官的初筛模型。2、将四种药物注射用乳糖酸红霉素，注射用硫酸链霉素，盐酸阿霉素和白消安作用于48孔板大鼠多器官原代细胞共培养模型；不同尺度的Nano-TiO2（5-10nm，60nm，90nm），不同尺度的Nano-SiO2（15nm，50nm，100nm），不同尺度的Nano-ZnO（30nm，50nm，100nm）三种纳米物质作用于该模型；24h后观察细胞形态学变化，并用MTT比色法测定细胞存活率，并计算各细胞的半数抑制浓度。结果1、48孔板的共培养模型方法稳定，细胞生长增殖状况良好，与单独培养时相比，无显著性差异。根据IC50值，百草枯（甲基紫精）对肺泡巨噬细胞毒性最大，其次是肾皮质细胞，对肝细胞毒性最小，这与目前整体动物显示肺脏是最敏感的靶器官是一致的；CCl4对肝细胞毒性最大，其次是肾皮质细胞、星形胶质细胞，然后是心肌细胞和肺泡巨噬细胞，这与目前整体动物显示肝脏是的CCl4最敏感的靶器官是一致的。2、四种药物作用于共培养模型发现：乳糖酸红霉素对肺泡巨噬细胞的毒性最大，星形胶质细胞次之，接着依次为心肌细胞、肾皮质细胞、肝细胞；剂量-效应曲线显示乳糖酸红霉素对各种细胞的毒性均具有明显的剂量依赖关系。根据IC50值，硫酸链霉素对肺泡巨噬细胞毒性作用最大，其次为肾皮质细胞、心肌细胞，然后是星形胶质细胞和肝细胞；剂量-效应曲线显示，硫酸链霉素对各种细胞的毒性均具有明显的剂量依赖关系且变化趋势相近，细胞存活率随药物浓度的增大逐渐降低。阿霉素对星形胶质细胞IC50值最小，其余由小到大依次为肺泡巨噬细胞、肾皮质细胞、肝细胞、心肌细胞；剂量-效应曲线显示阿霉素对各种细胞的毒性均具有明显的剂量依赖关系。白消安对星形胶质细胞的IC50值最小，其次是心肌细胞和肺泡巨噬细胞，两者相近，接着是肝细胞和肾皮质细胞。剂量-效应曲线显示，除肝细胞外，白消安对各种细胞的毒性均具有明显的剂量依赖关系，细胞存活率随着药物浓度的增大逐渐降低，以星形胶质细胞的变化趋势最为明显。3、除5-10nm外，同一尺度Nano-TiO2对大鼠多器官细胞共培养模型中不同细胞的毒性大小依次为：肺巨噬细胞>星形胶质细胞>心肌细胞>肝细胞、肾皮质细胞，这与目前整体动物毒性试验显示肺是Nano-TiO2最敏感的靶器官是一致的。其中5-10nm TiO2对星形胶质细胞的IC50值比肺泡巨噬细胞更低，提示随着尺度的下降，神经系统可能成为第二个靶器官。三种尺度Nano-TiO2对各器官细胞毒性的变化趋势相近，均随着尺度的下降细胞毒性增大，细胞毒性由大到小依次为：5-10nm>60nm>90nm。三种尺度Nano-SiO2对各细胞的毒性均有明显的剂量依赖关系，随着Nano-SiO2浓度的增大，细胞毒性逐渐增大。同一尺度Nano-SiO2对大鼠多器官细胞共培养模型中不同细胞的毒性大小依次为：肺巨噬细胞>星形胶质细胞>心肌细胞>肝细胞、肾皮质细胞，这与目前整体动物毒性试验显示肺是Nano-TiO2最敏感的靶器官是一致的。100nm和50nm的Nano-SiO2对各种细胞剂量-效应曲线除斜率有差异外，变化趋势相近；但15nm Nano-SiO2的曲线较其它两种尺度的较陡，细胞存活率随受试物浓度增加下降的更快。三种尺度的Nano-ZnO对大鼠多器官细胞共培养模型中不同细胞的毒性大小依次为：心肌细胞>星形胶质细胞>肝细胞>肾皮质细胞、肺巨噬细胞，这与目前整体动物毒性试验显示肺是Nano-ZnO最敏感的靶器官是一致的。不同尺度Nano-ZnO对各器官细胞毒性的变化趋势相近，均随着尺度的下降细胞毒性增大，细胞毒性大到小依次为：30nm>50nm>100nm。结论1、本试验将飞片法改为自己改制的48孔细胞共培养板、将原五种细胞中的真皮成纤维细胞改为星形胶质细胞，修改建立的大鼠体外多器官原代细胞共培养模型是成功的；经百草枯、四氯化碳的验证和四种新兴污染物、三种纳米材料的初步应用，表明该方法在化学物靶向性筛选和毒作用特征研究上有良好的应用前景。同时，应用研究提示，肺泡巨噬细胞是否足以代表肺脏，有待进一步改进。2、对几种药物也是新兴污染物的红霉素、链霉素、阿霉素和白消安的应用研究表明，除了局部毒性不能检测外，多数测试结果与已报道的器官毒性一致；除发现其在临床上常见的毒性外，还发现了这几种药物一些可能的潜在毒性。3、三种纳米材料均有明显的尺度效应，随着尺度的下降细胞毒性增大，敏感的器官细胞也增加，靶器官数目可能增加。Nano-TiO2的毒性靶器官可能是肺脏和神经系统；Nano-SiO2的毒性靶器官可能是肺脏和神经系统；Nano-ZnO的毒性靶器官可能是心脏。