随着肿瘤组织微环境对细胞行为影响的阐明,其在抗肿瘤药物筛选及细胞耐药性相关研究中的重要性逐渐被人们关注。已有研究分别表明,细胞外基质(ECM)硬度和氧气浓度对A549细胞的增殖、耐药性以及抗肿瘤药物毒性等具有显著的影响。然而,这两个微环境因素的协同作用却鲜有报道。基于以上原因,本研究利用微流控浓度梯度技术构建了可以同时产生正交、稳定且线性的水凝胶硬度和氧气浓度双梯度的体外肿瘤细胞三维培养平台,对双梯度进行了定量表征和数字化模拟,并将其成功应用于体外肿瘤细胞三维培养和抗肿瘤药物毒性的研究。本文设计了一个双层芯片装置,中间为PDMS薄膜层,使上下层芯片通道内的气体自由交换;上部芯片细胞培养通道为圣诞树结构,通过控制入口海藻酸钠水凝胶浓度,可在水平方向形成硬度梯度;下层通道利用邻苯三酚在碱性溶液中的吸氧反应,可在上层细胞培养池中形成与水凝胶硬度梯度方向相互垂直的稳定氧气梯度,以此探究在细胞外基质硬度与氧气浓度双重梯度的影响下,A549细胞的生长情况以及经药物刺激下细胞活性的差异。首先,本研究构建了0.5~58 kPa的海藻酸钠水凝胶的硬度梯度,通过数字化软件模拟,对芯片内形成的水凝胶浓度梯度进行计算表征,并与罗丹明B荧光染料的检测结果比照,发现实验结果与数字化模拟后的理论数值吻合。接着考察了不同流速下的邻苯三酚和氢氧化钠溶液在芯片中氧气浓度梯度形成的变化情况。通过调整下层氧气梯度芯片中反应液的流速,可在1μL/min的流速下形成1%-21%的氧气浓度梯度。芯片细胞活性实验实验表明,在单一氧气浓度梯度下细胞活力没有显著性差异,但是在固定氧气浓度条件下,当基质硬度增加时,细胞凋亡逐渐减少。而当处于正交双浓度梯度条件下时,使用抗肿瘤药物替拉扎明(TPZ)刺激后,包覆在较软基质中的A549细胞对于TPZ的耐药性明显高于较硬基质。此外,随着氧气浓度的降低,TPZ的细胞毒性呈增强趋势。由此可见,本研究设计的微流控芯片装置为体外肿瘤细胞相关研究提供了一个高度集成且易于操作和检测的平台,该平台可在氧浓度和基质硬度的正交双梯度作用下同时进行三维细胞培养和药物毒性测试,为肿瘤微环境中多因素对细胞行为的协同作用等方面的研究提供了参考依据,在生物医学研究领域具有潜在的应用价值。