在过去的近30年中，转基因技术在哺乳动物基因表达方面的研究应用，已经成为实验生物学及应用生物学领域最为显著的进展之一。传统的制作转基因动物方法有显微注射法、逆转录病毒感染法和胚胎干细胞法等，但每种方法都有其缺陷，限制了其在今后转基因动物研究中的广泛应用。通过睾丸注射法对体内生殖细胞进行外源基因转染是近些年来发展起来的一种进行转基因动物研究的新方法。由于其操作简便、成本低廉、效率较高且适于大量生产转基因动物的优点而越来越受到关注。但由于该方法起步较晚，目前还存在许多问题。因此，对该方法进行研究和完善，对今后制作和生产转基因动物，培育抗病动物品种以及通过建立转基因动物生物反应器生产珍贵蛋白等都具有重要意义。 本研究共分三部分： 第一部分：小鼠精子形成各阶段转基因效率的研究 本试验对小鼠体内生殖细胞进行外源基因转染，研究精子形成过程中制作转基因小鼠的效率。首先运用睾丸注射法将被脂质体包裹的绿色荧光蛋白表达载体(pIRES2-EGFP)注射到公鼠睾丸及附睾内，然后根据精子形成不同阶段，分别于注射后7d、16d、30d和42d与发情母鼠合笼，利用PCR和Southern印迹方法对新生小鼠进行基因组DNA检测。在各阶段所得新生小鼠中PCR阳性率分别为6.82％、0、56.86％和、42.86％，Southern印迹检测阳性率为分别为6.82％、0、47.06％、34.69％，经活体荧光成像系统及荧光显微镜分析，转基因小鼠呈现绿色荧光表达。通过比较精子生成各阶段转基因效率高低，为以后通过用睾丸内注射法转染雄性生殖细胞高效制作转基因动物提供了理论依据。 第二部分：睾丸注射法在不同生精周期制作转基因小鼠效率的研究 运用睾丸注射法将被脂质体包裹的绿色荧光蛋白表达载体(pIRES2-EGFP)注射到公鼠睾丸内，然后根据小鼠精子的形成周期，分别于注射后第42d、84d、126d、168d和210d即注射后连续5个周期内与正常发情母鼠合笼，利用PCR和Southern印迹方法对新生小鼠进行基因组DNA的跟踪检测。在各阶段所得新生小鼠中PCR阳性率分别为36.36％、17.78％、12.50％、10.87％、4.65％，Southern印迹检测阳性率为分别为31.82％、13.33％、8.33％、6.52％、2.33％，经活体荧光成像系统及荧光显微镜分析，转基因小鼠呈现绿色荧光表达。通过比较不同精子生成周期的转基因效率，初步表明精原干细胞可以长时间携带外源基因，但其效率随时间的延长而明显降低，这为今后通过用睾丸内注射法转染精原干细胞制作转基因动物提供了基础理论。 第三部分：睾丸注射法建立抗菌肽Thanatin转基因小鼠的初步研究 人工合成抗菌肽Thanatin基因的三条片段，利用重叠延伸PCR扩增技术得到完整的Thanatin基因，通过分子克隆方法构建出pIRES2-EGFP-Thanatin重组表达载体。然后与脂质体混合，采用睾丸打点注射将新构建的抗菌肽基因注入小鼠睾丸内，共注射公鼠5只。6周后与雌鼠交配，对F1代新生小鼠进行断尾，提取尾尖基因组DNA，利用PCR和Southern印迹方法对其进行检测，从检测阳性小鼠中随机挑选公、母鼠各3只分别与正常小鼠交配，用PCR方法对F2代进行检测。结果得到的52只F1代鼠中PCR检测阳性率为38.46％，Southern印迹检测阳性率为30.77％；转基因阳性小鼠所生55只F2代中，PCR检测阳性率36.36％；在活体荧光成像系统下转基因小鼠呈现绿色荧光表达。通过睾丸注射法使Thanation基因在小鼠的基因组中得到整合，为今后进一步研究抗菌肽的作用机理、培育抗病动物品种以及今后通过建立转基因动物生物反应器进行抗菌肽的大量生产打下了基础。