论文部分内容阅读
背景精神分裂症给病人带来极大的精神痛苦。虽然第二代抗精神分裂药如奥氮平对于精神分裂症的治疗效果显著,但是引起患者机体产生代谢紊乱(Metabolic syndrome,MS),引起机体产生胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)等严重不良反应。此类不良反应如血脂异常、葡萄糖不耐受、炎症和IR等己成为临床治疗精神疾病病人药物依从性低的重要因素。本研究发现慢性奥氮平治疗过程中,氧化低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein,Ox-LDL)在血浆中水平水平显著升高。而脂肪酸转运蛋白(Fatty acid translocase,CD36)是脂肪组织摄取Ox-LDL的转运酶。然而CD36的棕榈酸酰化作为必要翻译后修饰是其发挥脂肪酸转运功能的基础。因此,从奥氮平影响CD36棕榈酸酰化修饰角度探讨奥氮平引起MS的分子机制。目的基于长期服用抗精神分裂药奥氮平可能引起CD36棕榈酸酰化异常的角度,来阐明奥氮平引起MS的原因,探究奥氮平引起Ox-LDL的大量蓄积与CD36棕榈酸酰化修饰异常程度的关系。棕榈酰转移酶4(Asp-His-His-Cys-4,DHHC4)是CD36棕榈酸酰化修饰的催化酶,本研究更进一步探究奥氮平是否影响DHHC4活性从而导致机体产生MS。本研究目的是从奥氮平影响CD36的棕榈酸酰化修饰角度探究导致MS的可能机制。方法1.动物实验:40只SPF雌性SD大鼠平均体重230g随机分为奥氮平(OLZ)组和空白对照(BL)组。OLZ组灌胃给予1.5 mg/kg奥氮平,BL组每天一次给予相同体积的无菌生理盐水。每周对大鼠进行称重。每两周(2、4、6、8周)检测大鼠空腹血糖水平和血浆胰岛素水平,直到第8周喂食实验结束。第8周测试发现与BL组对比,OLZ组动物体重明显增加、并且胰岛素抵抗指数(Homeostasis model assessment insulin resistance,HOMA-IR)显著增加,OLZ组动物产生了MS和IR,则表明为建模成功。造模成功动物进行口服葡萄糖耐量试验(Oral glucose tolerance test,OGTT),并采集动物相应组织及血液样本。本研究使用Western-blotting和real time Q-PCR方法检测相关因子的蛋白质和基因表达水平;用ELISA试剂盒测定组织炎症因子变化如TNF肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素6(Interleukin-6,IL-6)以及Ox-LDL的表达水平。2.采用细胞学试验进行机制探究:将脂肪细胞系3T3-L1细胞进行诱导,诱导分化成功后加入奥氮平进行药物实验观察,并对3T3-L1细胞中CD36进行Western-blot和Q-PCR的表达分析。在3T3-L1细胞培养基中加入Ox-LDL标准品,并使用ELISA试剂盒测定3T3-L1细胞内Ox-LDL的浓度并进行分析。在拯救实验中,选用293T细胞进行瞬时DHHC4转染,构建过表达体系。构建成功后加入一定浓度的奥氮平进行干预,并对细胞CD36棕榈酸酰化修饰程度进行Western-blotting检测,对此定量分析。结果1.构建大鼠模型8周后,OLZ组与BL组大鼠相比,OLZ组的大鼠体重显著增加了20%(P<0.05),OLZ组空腹血糖显著升高了21%(P<0.05),并且OLZ组血浆中胰岛素的水平显著增加了65%(P<0.01),OLZ组的HOMA-IR显著高于BL组95%(P<0.01)。此外,OLZ组大鼠OGTT中大鼠血糖浓度-时间曲线下面积明显高于BL组26%(P<0.05)。表明长期服用奥氮平导致了大鼠产生脂代谢平衡和胰岛素抵抗。2.OLZ组与BL组大鼠相比,OLZ组血浆和脂肪组织中大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6均显著升高(P<0.05),表明奥氮平引起大鼠体内产生了炎症反应。OLZ组Ox-LDL的水平对比于BL显著提高了79%(P<0.01),并且对CD36进行Western blotting分析显示,OLZ组大鼠的脂肪组织中CD36对比于BL显著提高了591%(P<0.01),OLZ组大鼠的血浆中CD36对比于BL显著提高了98%(P<0.01)。对脂肪组织CD36的m RNA水平进行Q-PCR检测,与BL组相比,OLZ组m RNA水平显著增加79%(P<0.01)。此外,对脂肪组织中CD36的棕榈酸酰化水平进行Western blotting分析显示,OLZ组大鼠的脂肪组织中CD36棕榈酸酰化水平对比于BL显著减少了81%(P<0.01)。结果表明奥氮平影响了CD36棕榈酸酰化修饰水平,并影响了其对Ox-LDL的摄取吸收。3.对比于BL组,在大鼠脂肪组织中,奥氮平的长期诱导还引起了葡萄糖转运蛋白4型(Glucose transporter type 4,GLUT4)蛋白棕榈酸酰化水平显著降低了91%(P<0.01),和大鼠肉瘤(Rat sarcoma,Ras)蛋白棕榈酸酰化水平也显著降低了70%(P<0.01)。以上结果表明,奥氮平影响这些重要蛋白的翻译后棕榈酸酰化修饰。4.3T3-L1脂肪细胞培养结果显示,对比于BL组,CD36的mRNA水平显著增加了1351%(P<0.05),并且OLZ组CD36的蛋白表达量也显著增加。但3T3-L1脂肪细胞胞膜中CD36棕榈酸酰化水平显著降低了84%(P<0.05),OLZ组细胞膜中CD36的表达量显著减少了54%(P<0.05),并且OLZ组吸收Ox-LDL的水平也显著降低了18%(P<0.05)。在过表达DHHC4的293T细胞中,对比于BL组,DHHC4显著提高了细胞膜上CD36棕榈酸酰化水平64%(P<0.05),在此过表达体系基础上加入奥氮平干预,CD36的棕榈酸酰化显著降低了77%(P<0.05),并且明显低于BL组84%(P<0.05),表明奥氮平显著抑制了DHHC4的活性,导致CD36棕榈酸酰化水平显著下降。结论奥氮平长期诱导大鼠8周后,OLZ组大鼠产生了明显的MS和IR,表现为大鼠体重,血糖,胰岛素,HOMA-IR,均显著升高。炎症因子显著升高是导致IR的重要因素,血浆中Ox-LDL的水平异常是代谢紊乱的特征,这些指标均在奥氮平的诱导下显著升高。CD36的棕榈酸酰化是一种必要的翻译后修饰,直接影响对Ox-LDL等脂肪酸的转运作用。本研究发现慢性奥氮平诱导的胰岛素抵抗大鼠模型中CD36蛋白表达水平显著升高,然而CD36的棕榈酸酰化水平却显著降低,导致大鼠模型中血浆Ox-LDL显著增加。Ox-LDL显著增加是CD36棕榈酸酰化水平降低的主要标志。在3T3-L1脂肪细胞中,奥氮平显著增加了CD36的表达量以及m RNA表达水平,但却显著抑制了CD36的棕榈酸酰化水平,从而使奥氮平组细胞膜中CD36的分布大大减少,更是影响了对Ox-LDL的摄取吸收。为了探究奥氮平影响CD36的棕榈酸酰化的机制,在293T细胞中,通过构建DHHC4过表达体系,DHHC4可显著增加293T细胞胞膜上的CD36棕榈酸酰化水平,然而在奥氮平的干预下,过表达的DHHC4并没有使CD36棕榈酸酰化水平提高,表明DHHC4的活性显著受到了奥氮平的抑制。本研究探讨了奥氮平通过影响CD36的棕榈酸酰化角度引起MS等严重代谢症状,并且可能通过抑制DHHC4的活性,抑制了CD36棕榈酸酰化水平。探究干预奥氮平影响DHHC4活性的机制,将为今后缓解奥氮平诱导的MS提供一种可行的思路。