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背景:链霉菌是一类高GC含量的革兰氏阳性菌,能产生结构多样的次级代谢产物,这些代谢物具有广泛的生物活性,在临床、农业和生物技术方面具有广泛的应用。基因组测序揭示了许多链霉菌具有很大的潜力产生新的代谢产物,与已知天然产物的生物合成基因簇相比,这些链霉菌基因组中还含有很多隐性的生物合成基因簇,这些基因簇在实验室培养条件下是不表达的。玫瑰孢链霉菌是链霉菌的一种,因其能产生具有独特作用机制的环脂肽类抗生素达托霉素而受备受关注。基因组挖掘发现玫瑰孢链霉菌具有26个生物合成基因簇,除了少部分已经被分离鉴定的产物之外,还有大量的新的化合物资源有待挖掘。拟核结合蛋白是一类能够影响细菌染色体组织的蛋白,链霉菌中已确定的拟核结合蛋白有Hup A,Hup S,s IHF,Lsr2,Bld D和Crp。拟核结合蛋白通常相对非特异性地与基因组的不同区域结合,通过缠绕、弯曲或桥接远处的DNA造成DNA主要构象的改变,是组蛋白的功能同源物,不仅可以压缩染色体,而且在基因组全局性转录调控中也发挥着作用,影响基因的转录模式。Lsr2是放线菌中H-NS的功能同源蛋白,其序列与结构均不相似,但是Lsr2可回补大肠杆菌hns突变株的表型。在结核分枝杆菌中Lsr2与DNA小沟相互作用并靶向富含AT的序列。Lsr2结合导致基因转录抑制,通过弯曲或桥接在启动子区域的DNA以捕获或封闭RNA聚合酶来沉默基因的表达。所有链霉菌中均具有两个Lsr2同源蛋白,但其在玫瑰孢链霉菌的作用和机制尚不明确,研究Lsr2调控玫瑰孢链霉菌隐性基因簇的作用机制为激活隐性基因簇转录和得到新化合物提供了途径。目的:本文旨在研究Lsr2调控玫瑰孢链霉菌中生物合成基因簇的机制以及其对基因组中基因转录的影响,为激活隐性基因簇和发现新化合物提供新策略。方法:1.以结核分枝杆菌Lsr2蛋白序列进行在线BLAST,并构建进化树确定6种不同链霉菌中的Lsr2同源蛋白。2.通过RT-q PCR检测玫瑰孢链霉菌中lsr2和lsr L随时间的表达,利用CRISPR Cas9技术构建敲除菌株Δlsr2、Δlsr L、Δlsr2/L并检测其表型和次级代谢的变化,以此确定研究的同源基因,并进一步通过回补进行验证。3.为研究Lsr2对玫瑰孢链霉菌基因组的影响以及调控机制,检测以YMS培养基发酵的WT和Δlsr2的基因转录组,利用生物信息学分析基因转录水平的变化。4.为确定Δlsr2是否确实产生了化合物mureidomycin,将Δlsr2和阳性对照菌株Sros-h A的发酵液萃取旋蒸后通过HPLC和LC-MS鉴定是否含有产物mureidomycin。5.为研究Lsr2对mureidomycin生物合成的调控机制,通过构建mur A的过表达菌株和缺失菌株来检测mureidomycin的产生,并通过体外生化实验确定Lsr2与mur Ap以及Mur A与mur基因簇内启动子能否结合。6.为研究Lsr2功能结构域,通过序列比对确定玫瑰孢链霉菌中Lsr2 N端和C端的关键氨基酸,构建蛋白表达和回补的点突变载体,并通过体外生化实验和生物活性测定对Lsr2的功能结构域进行验证。7.为研究在其他链霉菌中Lsr2是否同样具有抑制生物合成基因簇的能力,构建白色链霉菌、委内瑞拉链霉菌和变铅青链霉菌的lsr2缺失株,并通过生物活性实验检测次级代谢产物的产生。结果:1.确定了6种链霉菌的Lsr2同源蛋白,玫瑰孢链霉菌中与结核分枝杆菌Lsr2同源性更高的为SSGG＿02869（Lsr2）,同源性较低的为SSGG＿03199（Lsr L）。2.RT-qPCR结果表明在所有时间点lsr2的表达量均比lsr L高,lsr L表达量维持在很低的水平。与WT相比,lsr2缺失后其表型和次级代谢均发生了变化,lsr L缺失后没有明显变化,lsr2回补后恢复至野生型表型。3.RNA-seq数据表明,lsr2缺失后约14%的基因差异表达,其中11个生物合成基因簇转录水平发生变化,Lsr2抑制了9个生物合成基因簇的表达。4.Δlsr2和对照菌株Sros-h A发酵产物萃取浓缩后,通过HPLC和LC-MS检测到Δlsr2和对照菌株发酵均产生了化合物mureidomycin。5.Mur A属于Lux R家族转录调控因子,是mur基因簇的途径特异性正调控因子,可以结合mur基因簇内的启动子区域,而Lsr2可以结合mur A启动子区域以抑制其生物合成。6.构建了Lsr2 Npm/Cpm蛋白表达载体,蛋白表达纯化后通过EMSA检测发现Lsr2 C端点突变后失去了结合DNA的能力。构建了点突变回补菌株lsr2CM Npm/Cpm,均不能恢复至野生型表型。7.构建了委内瑞拉链霉菌、变铅青链霉菌和白色链霉菌的lsr2缺失菌株SVENΔlsr2、SLIVΔlsr2、SAΔlsr2,变铅青链霉菌lsr2缺失后产生了红色化合物,白色链霉菌lsr2缺失后产生了抗新生隐球菌的活性物质,委内瑞拉链霉菌lsr2缺失后未检测到活性变化。结论:链霉菌中有两个Lsr2同源蛋白,玫瑰孢链霉菌SSGG＿02869和SSGG＿03199分别编码Lsr2和Lsr L。Lsr2对玫瑰孢链霉菌的生长没有显著影响,主要作为负调控蛋白调控隐性基因簇的表达,抑制了多个次级代谢基因簇的转录。Lsr2通过结合mur基因簇的途径特异性调控基因mur A的启动子区域来抑制mureidomycin的生物合成。初步探究了在其它链霉菌中Lsr2对次级代谢的影响,为研究Lsr2调控机制和激活隐性生物合成基因簇奠定基础。