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在哺乳动物中,表观遗传修饰对细胞增殖和胚胎的发育具有重要的调控作用,其中组蛋白的甲基化及乙酰化可改变染色体的构象,调控基因的表达与沉默,进而调节个体的发育。缺失的、小的、同源异形蛋白1(Absent small or homeotic 1,ASH1L)是一种组蛋白甲基转移酶,可通过甲基化H3K36、拮抗多梳蛋白的表达进而促进个体的生长与发育。本文研究ASH1L甲基转移酶在牛卵丘细胞及胚胎中的表达和功能,为进一步揭示其对胚胎的调控机制提供技术和理论基础。试验一:为探究ASH1L甲基转移酶在牛卵丘细胞中的表达与功能,对细胞中ASH1L表达进行检测。结果显示,ASH1L位于牛卵丘细胞的细胞核中,呈点状分布。成功筛选到能有效干扰牛Ash1L基因的siRNA-2,其干扰效率为60~70%。将siRNA-2转染卵丘细胞后,该干扰组细胞中H3K36me1/2/3三种甲基化水平均显著低于对照组(P<0.05);干扰Ash1L导致凋亡细胞数增多、凋亡相关基因Bax、Bcl-2及caspase-3表达水平显著上调,凋亡基因Bax和caspase-3表达量高于抗凋亡相关基因Bcl-2(1.311和1.179 vs 1.146);同时干扰Ash1L基因表达也引起PRC2蛋白亚基基因的表达量显著升高(P<0.05)。说明ASH1L蛋白在细胞凋亡中具有一定的调节作用。试验二:为探究ASH1L甲基转移酶在牛体外受精胚胎中的表达与功能,对各发育阶段胚胎中ASH1L的表达进行检测。结果显示,ASH1L蛋白存在于牛卵母细胞的细胞核、2-、4-、8-、16-细胞期胚胎的细胞核中,而在桑椹胚与囊胚期间,ASH1L在细胞核中呈点状分布;H3K36me2/3在牛卵母细胞和各发育阶段的体外受精胚胎中均能检测到,且其在4-细胞期胚胎中较弱,从8-细胞开始信号开始增强,直到囊胚。Ash1L基因表达量在16-细胞和桑椹胚期显著高于其他各时期(P<0.05)。注射siAsh1L后,囊胚发育率和质量显著下降(P<0.05)。多能相关基因mRNA表达量显著下降(P<0.05)。PRC2相关亚基EZH2在2-细胞到桑椹胚期表达量均显著升高(P<0.05);EED和Suz12在16-细胞和桑椹胚期表达量显著升高(P<0.05)。试验三:为预测ASH1L甲基转移酶的靶基因,揭示其对胚胎发育的调控机制,对其进行转录组测序,意在找出其靶基因。结果显示,共筛选出828个差异基因,其中上调基因514个,下调基因314个。GO注释共筛选出1723条GO条目,KEGG分析得出58条信号通路。ASH1L蛋白主要参与赖氨酸降解途径和紧密连接途径,其中差异倍数较大的为ACAT2及ZAK基因,两者均与细胞生长及胚胎发育相关,预测ASH1L酶的靶基因可能为ACAT2及ZAK,然而其与ASH1L甲基转移酶的作用机制和对胚胎发育的调控功能还需要进一步的研究。综上所述,ASH1L甲基转移酶存在于卵丘细胞、卵母细胞及早期胚胎的细胞核中;干扰Ash1L基因表达后,卵丘细胞的凋亡率显著增加,凋亡相关基因的表达水平升高,H3K36me1/2/3甲基化水平显著降低;抑制胚胎中Ash1L基因表达,胚胎发育率和囊胚质量显著下降,胚胎多能基因的表达水平降低,PRC2蛋白亚基基因表达量显著升高;通过转录组测序分析预测Ash1L甲基转移酶的靶基因为ACAT2和ZAK基因,为深入研究ASH1L酶在动物胚胎发育中的调控机制提供理论基础。