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志贺菌属细菌又称痢疾杆菌，它是引起细菌性痢疾(菌痢)的主要病原。本病是全球流行的传染病，尤其在卫生条件相对落后的国家发病率较高。目前我国尽管在菌痢的防治工作中已取得了重大成就，但由于人口众多，经济不发达，且志贺菌菌型复杂，易变迁，各菌型间无交叉免疫等原因，菌痢发病率一直处于较高水平，是我国夏秋季常见的肠道传染病。菌痢自广泛应用抗菌药物治疗以来，志贺菌不断产生耐药株，并呈多重耐药，不仅耐药率高，且耐药产生快及广泛，给本病的防治带来很大困难，从而造成本病蔓延及流行。1996年痢疾志贺菌被WHO认定为耐药性日渐增长给人类带来巨大威胁的细菌。研究志贺菌属的多重耐药机制，克服细菌多重耐药是提高菌痢防治水平的重要课题。大肠杆菌研究发现：AcrAB-TolC多重耐药泵系统在大肠杆菌多重耐药过程中起到重要作用，其耐药机制称之为主动流出机制，该机制是由染色体介导的在一个调节位点控制下的多基因协作表型，即导致细菌多重耐药泵蛋白表达增加，该泵系统可将结构不同的药物泵出细胞膜外，致胞内药物浓度达不到有效浓度，从而使细菌产生多重耐药。已有的研究发现，类似的多重耐药泵在肠道杆菌中广泛存在。为了解志贺菌属细菌的多重耐药机制及探索解决其问题的途径，本研究对临床收集的志贺菌进郑州大学硕士学位论文临床分离志贺菌属细菌多重耐药机制的研究行PCR扩增编码多重耐药泵蛋白的结构基因acrAB一tolC、运用PCR一SSCP对其突变性进行检测、N。找hem印迹检测其表达情况，并在实验室研究泵蛋白抑制剂MC207，1 10对志贺菌的作用。方法 1.多重耐药株和敏感野生株的筛选:采用琼脂稀释法测定抗菌药物对志贺菌的最低抑菌浓度(minlrnu工n inllibition coneentration，MIC)。以实验室耐四环素、氯霉素、氨节青霉素、毗呱酸或环丙沙星的菌株为多重耐药株(multiPle antibioticresistant，Mar)，均敏感的菌株为敏感野生株(丽ld tyPe，WT)。 2.志贺菌细胞内环丙沙星的积聚:应用荧光法测定志贺菌细胞内环丙沙星的积聚。积聚试验均于37’C水浴中进行，样品用预冷至0℃的0.1 mol几(pH 3.0)的甘氨酸溶液处理。志贺菌细胞内环丙沙星浓度为OD60。=10时每升菌液细胞内所含的环丙沙星毫克数表示。 3.多重耐药泵系统acrAB一olC基因的单链构象多态性(P CR一5 5 CP)分析:PCR扩增acrAB一tolC基因，扩增产物经限制性内切酶EcoRI(Alul)消化(或不消化)，变性后经中性聚丙烯酸胺凝胶电泳，根据单链带数目和位置判断有无基因突变。 4.采用随机引物法标记探针:将待标记的DNA探针片段变性后与随机引物杂交，然后以此杂交的寡核昔酸为引物，在DNA聚合酶I大片段的催化下，合成与探针DNA互补的DNA链，反应液中含有DIG一dUTP，即形成地高辛标记的DNA探针。 5.Northem印迹:提取细胞总RNA，行甲醛变性凝胶电泳，将RNA转移至尼龙膜，在含有探针的杂交液中杂交，应用地高辛检测试剂盒检测杂交结果，根据杂交条带密度半定量细胞中mRNA表达水平。结果郑州大学硕士学位论文临床分离志贺菌属细菌多重耐药机制的研究 1.多重耐药株和敏感野生株的筛选:根据临床上分离的141株志贺菌对四环素、氯霉素、氨节青霉素、毗呱酸或环丙沙星5种抗生素的药敏试验结果，筛选出64株多重耐药株，6株敏感野生株。 2.志贺菌细胞内环丙沙星的积聚:敏感野生株细胞内环丙沙星稳态浓度约为多重耐药株Marl的2.5倍，为多重耐药株MarZ的1 .5倍，差异有显著性(P<0 .0001)。加入能量抑制剂CCCP后，多重耐药株Marl细胞内环丙沙星稳态浓度上升了2.2倍，多重耐药株MarZ上升了0.8倍，敏感野生株上升了0.3倍，各组之间比较差异有显著性(尸<0 .0001)。 3.32株志贺菌属多重耐药株和6株敏感野生株及标准株全部分别扩增出1697bp、510 bp和1633 bp长度的片段，分别是aerA、aerB和tolc基因的扩增产物，未发现多重耐药泵基因缺失株。 4.多重耐药泵系统acrAB一to1C基因的单链构象多态性(P CR-SsCP)分析:对38株临床分离志贺菌属细菌研究，发现4株多重耐药株acrA基因突变，突变率为103%;有1株敏感野生株tolC基因突变，突变率为2.6%;未发现acrB基因突变株。 5.随机引物法标记探针:随机引物法标记的探针浓度分别约为:acrA基因为990 ng/协l、acrB基因800 ng/协l和tolC基因900 ng/林l。 6.多重耐药泵系统acrAB一tolC表达水平结果分析:多重耐药株Marl、MarZ其acrA基因表达水平显著高于敏感野生株(尸<0.05);多重耐药株Marl、MarZ其acrB基因表达水平略高于敏感野生株，但统计学比较差异无显著性，F=0.92，尸二 0.45;多重耐药株Marl、MarZ及敏感野生株其tolC基因表达水平经统计学比较差异无显著性，F=0.39，尸二0.76。 7.多重耐药泵抑制剂MC一207，110对志贺菌的抑制作用结果分析:在多重耐药泵基因高表达的一些菌株中作用明显，该抑制剂可通过抑制多重耐药泵从而使郑州大学硕士学位论文临床分离志贺菌属细菌多重耐药机制的研究环丙沙星对志贺菌相?