论文部分内容阅读
目的：胃癌发病率较高，手术治疗预后欠佳，现有的放疗及化疗的副作用比较大，造成病人难以耐受。我国传统医学的中医药治疗以其安全、有效且廉价的特点，越来越受到人们的关注。本课题选用两种常见的胃癌细胞株（SGC-7901和MKN45），拟通过细胞学、分子生物学以及动物学等多种研究技术，明确黄芩素在体内外诱导胃癌细胞凋亡的作用及其诱导凋亡的可能分子作用机制;通过黄芩素对凋亡通路上各相关调控分子(caspase家族、Bcl-2家族)表达水平的影响，以期找出其诱导凋亡的相关信号转导通路和作用靶点。为胃癌中药综合治疗提供实验基础。研究方法：通过MTT检测法,细胞集落形成实验等多种手段，检测不同浓度黄芩素干预下，胃癌细胞的增殖抑制；用流式细胞术检测胃癌细胞周期的改变和凋亡细胞的比例。通过免疫印迹法和real-time PCR检测黄芩素干预后胃癌细胞内各凋亡相关通路基因的蛋白表达及转录的变化。通过裸鼠移植瘤模型的体内实验，验证黄芩素对于胃癌细胞增殖的抑制作用。结果：体内实验结果显示，不同浓度的黄芩素（0μmol/l、15μmol/l、30μmol/l、60μmol/l、120μmol/l）作用于胃癌细胞48小时后，SGC-7901细胞的存活率分别是94.80±5.17%，81.53±4.33%，48.98±3.56%，37.45±3.88%和38.14±3.72（P<0.01）; MKN45细胞的存活率分别是95.30±5.12%,79.53±4.46%,51.98±4.32%,33.45±4.15%,37.14±3.23%（P<0.01）。结合黄芩素作用24小时和72小时的细胞存活率，黄芩素在体外能够以时间-剂量依赖的方式来明显抑制胃癌细胞的增殖。我们通过流式细胞术检测了不同黄芩素浓度下胃癌细胞的细胞周期分别和凋亡的情况，结果发现两种胃癌细胞都发生了S期阻滞，凋亡细胞的百分比呈浓度依赖性增加。Hoechst染色发现黄芩素作用后胃癌细胞出现了凋亡小体等细胞形态学的特异性改变，改变也呈黄芩素剂量依赖性。JC-1染色法检测到胃癌细胞内的线粒体膜电位的丧失，其程度呈黄芩素剂量依赖性。免疫印迹法和real-time PCR的结果显示，黄芩素处理后的胃癌细胞中与内源性凋亡途径相关的caspase-9被活化，而与外源性凋亡途径相关的caspase-8活化不明显，说明黄芩素诱导凋亡的作用与内源性凋亡途径有关；黄芩素能下调抗凋亡Bcl-2亚家族中Bcl-2和Bcl-xL的转录和表达，上调促凋亡Bcl-2亚家族中Bak、Bid、Bad和Bax的转录和表达，变化呈浓度相关性。动物实验中，大剂量药物组的裸鼠[给予50mg/(kg．d)]相对于小剂量药物组的裸鼠[给予15mg/(kg．d)]和对照组，其移植瘤生长速度最慢，质量最小；对照组移植瘤具有最快的生长速度和最大的质量。经过免疫印迹法检测，移植瘤内的凋亡相关蛋白的表达与体外研究相一致。结论：黄芩素在体内外实验中均能抑制胃癌细胞增殖，诱导其凋亡的作用，且此作用呈剂量依赖。黄芩素能够上调Bcl-2家族促凋亡分子Bid、Bad、Bak和Bax的转录及表达，下调促存活分子Bcl-2和Bcl-xL的转录和表达。因此我们推论，黄芩素可能通过调控Bcl-2家族来实现对胃癌细胞增殖的抑制，诱导胃癌细胞凋亡。黄芩素作为一种低毒安全廉价的中药成分，为胃癌的综合治疗提供了更多选择的可能。