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贯叶连翘(Hypericum perforatum L)是一种重要的植物药物。大量临床前和临床研究证实,贯叶连翘提取物具有抗肿瘤、抗病毒、抗抑郁等多种功效。其主要活性成分金丝桃素对多种肿瘤细胞具有光动力学毒性。国际市场上通常以金丝桃素的含量作为贯叶连翘提取物质量标准。
我国贯叶连翘资源十分丰富,但目前贯叶连翘提取物中的有效成分含量较低。研究改进金丝桃素提取和纯化的方法,提高金丝桃素的含量,有利于充分利用贯叶连翘资源。
本课题尝试多种方法提取和纯化金丝桃素、伪金丝桃素、金丝桃苷,并研究确立了金丝桃素、伪金丝桃素、金丝桃苷和芦丁的定性和定量分析方法,以上四种物质是贯叶连翘中最具活性的物质,前三种物质也是最难得到高纯度的物质。
主要的工作和结论如下：
1.金丝桃素和伪金丝桃素分析方法的建立。薄层检测：固定相：硅胶GF254高效预制板,流动相为氯仿:甲醇=8.5:1.5,二氯甲烷:甲醇=9:1,石油醚:乙酸乙酯:甲醇=5:20:2。HPLC检测方法：流动相：甲醇-0.006 mol/1 Na2HPO4(0.1 mol/l H3PO4调pH 6.5)=7:1,检测波长为590 nm,柱温为30℃,流速为1.0 ml/min,色谱柱采用依利特KromasilC18(4.6 mm×200 nm,5μm)。
2.金丝桃素和伪金丝桃素的提取纯化工艺。第一步超声提取：60％的乙醇作为溶剂,一次性连续超声120 min,液固比为50:1;第二步Ab-8大孔树脂纯化：洗脱流动相依次为20％、40％、80％乙醇,收集80％洗脱液；第三步两次硅胶纯化：流动相分别为石油醚-乙酸乙酯-甲醇和二氯甲烷-甲醇；最后采用与液相检测相同的流动相在ODS(Octadecylsilyl)柱上进一步纯化,纯度分别达到95.3％和 98.5％。并对工艺进行放大,纯度分别达到85.7％和87.7％。
3.金丝桃素和伪金丝桃素的HPLC制备方法的建立。原料为一次硅胶后样品,制备方法为：流动相：甲醇-0.006 mol/l Na2HPO4(0.1 mol/l H3PO4调pH至6.5)=8:1;流速,2 ml/min;检测波长,590 nm,色谱柱为瑞典Kromasil C18(10 mm×250 mm,5μm),金丝桃素和伪金丝桃素纯度分别可达到88.4％和86.3％。
4.金丝桃苷和芦丁的检测方法。薄层检测：固定相为硅胶GF254高效预制板,流动相为乙酸乙酯:甲酸:甲醇=8:1:1;金丝桃苷HPLC检测:流动相:甲醇-0.5％磷酸=45:55(三乙胺调pH=3);柱温：30℃；流速：1.0ml/min;检测波长：360nm;芦丁HPLC检测：流动相：甲醇-0.4％磷酸=40:60;柱温：30℃；流速：1.0 ml/min;检测波长：360 nm；色谱柱皆为Agilent ZORAX SB-C18(4.6 mm×250mm,5μm)。 5.金丝桃苷提取纯化。第一步D-101大孔树脂纯化：流动相为60％乙醇；第二步聚酰胺两次纯化：流动相分别为60％乙醇和 20％乙醇,最终金丝桃苷质量百分含量达到80.7％。