研究背景和目的：心血管疾病是严重危害人类健康的常见病。一氧化氮介导的内皮依赖性血管舒张反应降低是大多数心血管疾病的早期病理表现。大量研究表明，内源性一氧化氮合酶(NOS)抑制物一非对称性二甲基精氨酸(ADMA)是导致血管内皮功能不全的重要物质。二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)是内源性ADMA的主要代谢酶。已知DDAH存在两种亚型--DDAHl和DDAH2；前者主要分布于表达神经型NOS的组织，后者则主要分布于表达内皮型NOS的心血管组织；因此，DDAH2是决定心血管系统ADMA含量的关键因素。但目前尚无直接增加DDAH2表达和活性的药物。近年来发现一种来源于人类免疫缺陷病毒HIV-1 Trat(Trans-activatot transcription)蛋白的蛋白功能区，称之为PTD区段(Protein transduction domain)，能有效地引导肽段或蛋白质进入细胞，具有蛋白传送功能。因此，本课题将Tat PTD区段融合于人DDAH2蛋白的N端，使DDAH2蛋白具备穿膜能力，定位于细胞内并发挥作用。在此基础上，用多种心血管的危险因子如高糖、同型半胱氨酸、游离脂肪酸如棕榈酸处理培养的人脐静脉内皮细胞系(HUVEC-12)，观察上述因素对细胞内DDAH1和DDAH2表达及DDAH活性的影响：并进一步探讨外源性给予Tat-hDDAH2蛋白能否直接增加细胞中DDAH2蛋白含量，抵抗上述因素对DDAH活性的抑制，从而为大规模开发可应用的重组蛋白产品奠定技术基础，为心血管疾病防治拓开新途径。另一方面，用重组的DDAH2融合蛋白作为抗原，制备家兔来源的抗血清，用于DDAH2表达的检测。 方法：①构建重组pGEX-6p-1-Tat-hDDAH2原核表达载体：以我室以前构建pcDNA3.1-hDDAH2质粒为模板，用Tat-hDDAH2上下游引物扩增Tat-hDDA1-12基因，重组到T载体上，构建pGEM-Tat-hDDAH2质粒，然后再分别用Sal I和BamH I双酶切pGEM-Tat-hDDAH2和原核表达载体pGEX-6p-1，连接重组成pGEX-6p-1-Tat-hDDAH2载体；再转化到宿主大肠杆菌BL21体内诱导表达，并通过优化诱导条件提高目的基因的原核表达水平和可溶性融合蛋白的含量。②重组Tat-hDDAH蛋白的纯化：将包涵体形式的重组蛋白溶于8 mol/L的尿素溶液中，然后经过复性、透析得到复性蛋白GST-Tat-hDDAH；再将从细菌裂解液上清中的可溶性GST-Tat-hDDAH蛋白和从包涵体中得到的复性蛋白与还原型谷胱甘肽琼脂糖珠(Glutathione Sepharose 4B)充分混匀，经过Glutathione Sepharose4B的亲和吸附得到纯化的GST-Tat-hDDAH2融合蛋白，最后经过PreScission蛋白酶切，获得重组的Tat-hDDAH2蛋白。③抗hDDAH2抗血清的制备：重组pGEX-6p-1-hDDAH2载体；一再转化到宿主细菌体内进行诱导表达，得到大量含GST-hDDAH2蛋白的包涵体；经2％的脱氧胆酸钠溶液洗涤后得到较纯化的包涵体，并将其作为抗原与佐剂充分乳化后经皮下注射免疫新西兰大白兔，制备抗DDAH2的多克隆抗体，并用ELISA、western blot检测DDAH2抗体的滴度和特异性，用于后续实验中DDAH2蛋白表达的检测。④重组Tat-hDDAH2蛋白的功能实验：培养人脐静脉内皮细胞系HUVEC-12，分别用心血管疾病的危险因子高糖、同型半胱氨酸、游离脂肪酸如棕榈酸(palmitic acid，PA)孵育HUVEC-12 16～48h，检测这些危险因子对内皮细胞DDAH1和DDAH2蛋白表达和DDAH活性的影响；并观察Tat-hDDAH2蛋白能否逆转上述因素对DDAH活性的损害。 结果：①经PCR、酶切及测序鉴定，原核表达载体pGEX-6p-1-Tat-hDDAH2和pGEX-6p-1-hDDAH2(Fig.4)构建成功；并转化BL21大肠杆菌诱导表达，通过筛选不同的诱导条件，发现用较低的IPTG浓度(0.05 mM)在低温(250c)环境下和适当地延长诱导时间(8h)有利于可溶性融合蛋白GST-Tat-hDDAH2和GST-hDDAH2在细菌体内的表达，但在原核细胞中仍以不溶性的包涵体为主：将包涵体变性、复性后，再经纯化和PreScission蛋白酶酶切，最后获得重组的Tat-hDDAH2和hDDAH2蛋白。②将1升含有pGEX-6p-1-Tat-hDDAH2质粒和pGEX-6p-1-hDDAH2质粒的细菌培养液于12000 rpm 40c离心10 min，去上清，将细菌用100 mlPBS重悬；经超声裂解后于12000 rpm 40c离心10 min，分离上清中的可溶性融合蛋白与包涵体；将包涵体变性、复性后，分别将包涵体中复性的融合蛋白和上清中可溶性的融合蛋白经Glutathione Sepharose 4B亲和吸附，得到纯化的GST-Tat-hDDAH2融合蛋白2.169 mg和纯化的GST-hDDAH2融合蛋白2.571 mg；再分别将GST-Tat-hDDAH2和GST-hDDAH2融合蛋白经PreScission蛋白酶酶切后，可得到总量为1.362 mg的Tat-hDDAH2重组蛋白和1.469 mg的DDAH2重组蛋白。③用含GST-hDDAH2蛋白的包涵体免疫新西兰兔，10 W后用乌拉坦(0.8 g/kg，i.v.)麻醉，经颈动脉插管取血，3000 rpm 40c离心10 min分离血清，加入终浓度为0.02％的叠氮钠，从而获得特异性抗hDDAH2、效价达1:10000以上的多克隆抗体，分装后于-80。C保存，用于本课题中重组DDAH2蛋白、重组Tat-hDDAH2蛋白的检测以及内皮细胞中的DDAH2蛋白表达测定。④分别用0.1～1μM的Tat-hDDAH2蛋白孵育内皮细胞60 min，检测内皮细胞中DDAH2的表达及DDAH活性，以了解Tat-hDDAH2蛋白作用的量.效关系，结果发现，Tat-hDDAH2蛋白呈剂量依赖性地上调DDAH2表达，增加DDAH活性；再分别用1μM的Tat-hDDAH2蛋白孵育内皮细胞5～60 min，以观测Tat-hDDAH2蛋白作用的时.效关系，同样发现，Tat-hDDAH2蛋白呈时间依赖性地上调DDAH2表达，增加DDAH活性。此外，用10～30mM的葡萄糖孵育内皮细胞48h，以及用1～3 mM的同型半胱氨酸和0.1～0.5 mM的棕榈酸孵育内皮细胞16h，均能呈剂量依赖性地抑制DDAH2表达，降低DDAH活性；用0.1～0.5μM的Tat-hDDAH2蛋白预孵育内皮细胞1h，能逆转上述损伤因素对DDAH2表达和DDAH活性的抑制。 结论：①利用分子重组技术，成功地构建了pGEX-6p-1-Tat-hDDAH2和pGEX-6p-1-hDDAH2原核表达载体：②分别将pGEX-6p-1-Tat-hDDAH2和pGEX-6p-1-hDDAH2载体转化BL21大肠杆菌，经纯化后获得了较高纯度的Tat-hDDAH2和hDDAH2重组蛋白，实验证明，重组的Tat-hDDAH2具有强的穿膜能力，并呈剂量和时间依赖性地增加内皮细胞中DDAH2的蛋白含量，上调DDAH活性，具有良好的功能；③利用重组的GST-hDDAH2包涵体蛋白免疫新西兰大白兔，成功地制备了高效价的抗hDDAH2的多克隆抗体，并能特异性地检测重组的GST-hDDAH2、Tat-hDDAH2和hDDAH2以及人脐静脉内皮细胞表达的DDAH2蛋白；④本研究揭示，高糖、同型半胱氨酸和游离脂肪酸如棕榈酸等心血管危险因子抑制内皮细胞DDAH活性主要与下调DDAH2表达有关；重组的Tat-hDDAH2蛋白能呈剂量依赖性地逆转上述损伤因子对人脐静脉内皮细胞DDAH2表达和DDAH活性的抑制。