【摘 要】
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背景:在缺血性卒中的慢性期,血管新生为缺血脑组织提供充足的氧气和营养物质,为神经再生提供必要的因子及解剖支持,从而对卒中症状的改善起着非常重要的作用。实验证明了微小RNA-126在胚胎发育时期,通过抑制PIK3R2及SPRED1的表达,激活VEGF信号通路,参与了血管新生的调控,但是其在缺血性卒中中的功能还不清楚。我们假设在脑缺血小鼠的脑内过表达微小RNA-126可以促进卒中小鼠神经功能恢复。应用
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背景:在缺血性卒中的慢性期,血管新生为缺血脑组织提供充足的氧气和营养物质,为神经再生提供必要的因子及解剖支持,从而对卒中症状的改善起着非常重要的作用。实验证明了微小RNA-126在胚胎发育时期,通过抑制PIK3R2及SPRED1的表达,激活VEGF信号通路,参与了血管新生的调控,但是其在缺血性卒中中的功能还不清楚。我们假设在脑缺血小鼠的脑内过表达微小RNA-126可以促进卒中小鼠神经功能恢复。应用血管新生体外模型、免疫荧光、聚合酶链式反应（real-time PCR）、免疫印迹反应（Western blot）、及荧光素酶报告基因系统,在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）及小鼠永久性脑缺血模型中,我们探索了以下三个问题:1)微小RNA-126两条链即微小RNA-126-3p和微小RNA-126-5p对内皮功能的调控是否有差异;2)脑内过表达微小RNA-126是否促进了大脑中动脉栓塞小鼠神经功能的恢复;3)在脑缺血小鼠中微小RNA-126过表达促进神经功能恢复的机制。材料与方法:采用3D基质胶（matrigel）的方法检测微小RNA-126-3p和微小RNA-126-5p对人脐静脉内皮细胞成管功能的影响;采用迁移小室（transwell）实验检测微小RNA-126-3p和微小RNA-126-5p对人脐静脉内皮细胞迁移功能的影响;采用Brd U免疫荧光染色方法检测微小RNA-126-3p和微小RNA-126-5p对人脐静脉内皮细胞增殖功能的影响。建立大脑中动脉栓塞小鼠模型,采用慢病毒过表达技术在脑缺血小鼠脑内过表达微小RNA-126,探索微小RNA-126对脑缺血小鼠神经功能的影响,利用免疫荧光、聚合酶链式反应、免疫印迹、结合数据库及荧光素酶报告基因系统探讨微小RNA-126的作用机制。结果:我们首先在体外检测了微小RNA-126的两条成熟单链,即微小RNA-126-3p和微小RNA-126-5p,调控人脐带静脉内皮细胞（HUVEC）血管新生相关功能的作用。实验结果提示微小RNA-126-3p对于人脐带静脉内皮细胞成管的促进作用优于微小RNA-126-5p（p<0.05）,但是在促进人脐带静脉内皮细胞迁移和增殖方面,微小RNA-126-3p和微小RNA-126-5p无明显的差异。鉴于以上体外实验的结果,我们进行了小鼠在体实验。在大脑中动脉栓塞术后7天,应用前体微小RNA-126构建的慢病毒-微小RNA-126,对卒中小鼠进行立体定位注射。慢病毒-微小RNA-126在脑内可以被剪切形成成熟体微小RNA-126-3p和微小RNA-126-5p。与注射慢病毒-GFP的对照小鼠比较,注射慢病毒-微小RNA-126的小鼠,脑萎缩体积更小（p<0.05）,运动行为学恢复得更好（p<0.05）。进一步检测脑内血管新生和神经再生的指标,我们发现慢病毒-微小RNA-126组亦优于慢病毒-GFP组（p<0.05）。慢病毒-微小RNA-126组激活了与血管新生和神经再生相关的AKT和ERK信号通路。通过数据库搜索、real-time PCR、Western blot确定酪氨酸蛋白磷酸酶细胞膜非受体9型（PTPN9）为微小RNA-126的靶点,经过双荧光素报告酶实验确定PTPN9为微小RNA-126-3p和微小RNA-126-5p的靶点。结论:本实验中,我们证明了在小鼠脑中,PTPN9是微小RNA-126-3p和微小RNA-126-5p的作用靶点。提示微小RNA-126增高可以改善卒中后的运动行为学,并且这种功能是通过直接抑制PTPN9,激活AKT和ERK信号通路,从而促进血管新生和神经再生。
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