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自噬(Autophagy, AP)是真核生物在正常的生长发育过程中,或者遭受生物、非生物胁迫时细胞质组分降解-再利用的方式之一,对于维持细胞的稳态平衡、发育模式的重构、自体免疫以及抗氧化胁迫等方面都有着重要的作用。此外,有研究表明自噬还与植物的抗逆性相关。参与自噬过程的基因被称为自噬相关基因(Autophagy-related gene, ATG), ATG8是ATG基因家族重要的成员之一,与自噬体的形成密切相关。此前,本课题组在雄性可育系(Male fertility, MF)和不育系(Male sterile, MS)的油菜(Brassica napus L.)小孢子母细胞中发现存有类似植物自噬体(泡)结构,并且克隆出了ATG8基因(命名为BnAtg8)。本实验将BnAtg8和BnAtg8-GFP分别导入甘蓝型油菜MF和MS系基因组建立了相应的BnAtg8过表达系,旨在通过对这些转基因系的形态学、遗传学、细胞生物学和分子生物学分析,进一步确认小孢子母细胞中自噬体(自噬现象)的存在及其形成机制。主要研究结果如下：(1)以油菜的下胚轴为受体,结合农杆菌介导的遗传转化和离体诱导植物再生,经过PCR鉴定,共得到8个MF-BnAtg8(MFA1-8)、10个MF-BnAtg8-GFP (MFAG1-10)、11个MS-BnAtg8(MSA1-11)和11个MS-BnAtg8-GFP(MSAG1-11)过表达转基因系。(2)在含有潮霉素平板上对以上转基因系T1代进行筛选,共得到4个具单拷贝插入的转基因杂合系(MFAG-2、MFAG-3、MSA-7和MSAG-7)。与MF相比,MFAG-2的花序茎明显变细,MFAG-3的果荚数明显减少,MFAG-2和MFAG-3的分支数明显减少。与MS相比,MSA-7和MSAG-7分支数明显减少。(3) RT-PCR半定量检测发现,在以上4个转基因系当中,BnAtg8转基因均有表达,表达水平都低于内源Atg8基因的表达水平。(4)激光共聚焦显微镜观察发现,MFAG-2和MSAG-7的幼苗根尖均显示GFP荧光信号,但荧光信号定位有所不同：在MFAG-2中主要集中在分生区和伸长区,而在MSAG-7中主要集中在分生区和根冠区。观察子叶原生质体发现GFP信号主要分布在叶绿体周围。(5)用自噬体特异性染色剂MDC对MFAG-2和MSAG-7幼苗根尖染色后用激光共聚焦显微镜观察发现,在MFAG-2中MDC信号主要分布在分生区和伸长区,而在MSAG-7中MDC信号主要分布在分生区和根冠部位。MDC与GFP信号出现位置基本一致。MDC信号定位和强度在转基因和野生型根尖中无明显区别。(6)研究MFAG-2和MSAG-7转基因系的抗盐性发现,在盐(NaCl)胁迫条件下(150mmol,12h光照/12h黑暗,7d),野生型(MF、MS)和转基因系初生根和下胚轴的生长速率与对照组相比都明显下降,但是转基因系降低的程度明显小于野生型。(7)分析MFAG-2和MSAG-7转基因系对饥饿胁迫的响应发现,在不加碳(蔗糖)的培养基上培养7天后,初生根和下胚轴伸长的速率在野生型和转基因系之间无明显差异。以上结果说明,BnAtg8的过表达可以提高油菜的抗盐性,也表明自噬与植物的抗盐性可能有关。因时间关系,仅对转基因系的表型,生理生化和分子生物学特征进行了初步分析。对于转基因系内BnAtg8-GFP在花粉母细胞中的情况有待进一步研究。