目的：乳腺癌是导致女性癌症死亡的第二大主要原因，其发病率及死亡率在我国及全世界呈上升趋势。在中国，每年因乳腺癌死亡的人数约40,000人。近几十年来，尽管放疗、化疗及多种生物治疗手段有了长足发展，然而，乳腺癌转移、复发及化疗耐药等仍是乳腺癌治疗的难题。越来越多证据表明，微小RNA（microRNA, miRNA）参与了肿瘤的发生发展，积极探索乳腺癌侵袭转移机制、寻找新的治疗靶点，克服化疗耐药，将为临床治疗乳腺癌提供重要的实验依据。MicroRNA-155是一类多功能microRNA。人类miR-155基因，由BIC基因编码，位于21q21.3号染色体。最早发现，miR-155在多种病理生理过程中发挥重要作用，如造血系统分化、免疫、炎症、病毒感染、肿瘤、心血管疾病及唐氏综合症等。作为一种重要的oncomiR，在人类多种肿瘤中，miR-155过度表达，且与肿瘤的增殖、凋亡、转移及预后不良密切相关。在小鼠乳腺上皮细胞模型中，miR-155可靶向Rho A促进TGF-β诱导的EMT过程。此外，miR-155在促进肿瘤细胞增殖及抗凋亡中也发挥重要作用。通过对一系列人类乳腺癌细胞株的研究发现，在高表达miR-155的乳腺癌细胞株HS578T中，通过miR-155ASO抑制miR-155表达，可导致细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡；而在低表达miR-155的BT474乳腺癌细胞株中，异位高表达miR-155可促进细胞增殖，增强化疗抵抗。在MCF-7细胞中，miR-155高表达同样促进了细胞的增殖，而抑制miR-155表达可减慢细胞增殖速度，诱导肿瘤细胞放疗抵抗。许多研究表明，miR-155不仅参与肿瘤的发生发展，同样，在肿瘤预后及放化疗抵抗中同样发挥重要作用。在肺癌中，miR-155的高表达与患者预后不良有关。缺氧可诱导非小细胞肺癌细胞株A549及H460中miR-155的表达增加，抑制miR-155的表达，可提高该细胞的放疗敏感性。虽然以往大量研究表明，miR-155做为oncomiR促进了肿瘤的发生发展，然而，在另外一些肿瘤中，miR-155却发挥抑瘤作用。在人宫颈癌细胞株Caski中，miR-155过表达可抑制EGF诱导的EMT转化,降低了侵袭/转移能力，抑制了细胞增殖，提高了Caski对顺铂的化疗敏感性。Xiang等在建立的以4T1为肿瘤模型的动物实验中发现，稳转miR-155的4T1细胞在小鼠体内转移能力明显降低，然而，若直接将肿瘤细胞注射至尾静脉，miR-155却明显促进了肿瘤的肺转移。LI等在通过分析胃癌细胞株中miRNA的表达变化发现，与永生化的胃上皮细胞GES-1相比，在其研究的胃癌细胞株（MKN-45、MKN-28、SGC-7901、NCI-N87、AGS）中miR-155表达均降低。外源转染miR-155可明显抑制胃癌的转移侵袭能力。划痕实验及transwell迁移侵袭实验结果显示，转染miR-155mimics组细胞迁移侵袭能力降低。miR-155在不同肿瘤中的作用众说纷纭，究竟是什么原因导致miR-155的作用有如此大的不同？还有待于我们进一步研究。为此，本研究以小鼠乳腺癌细胞株4T1为模型，通过建立高表达及低敲miR-155的4T1细胞株，研究miR-155对4T1细胞增殖、转移、侵袭、凋亡等生物学行为的影响，进而探寻miR-155影响4T1转移侵袭的靶点。化疗是乳腺癌治疗的常用治疗手段，本课题通过进一步研究乳腺癌一线化疗药物阿霉素作用于4T1细胞后miR-155的表达变化，探讨了高表达miR-155对阿霉素作用的影响，旨在进一步了解miR-155在小鼠乳腺癌细胞株4T1进展、治疗中的作用，以期为临床治疗肿瘤提供新的治疗视角。方法：1应用慢病毒载体，建立miR-155高表达稳转细胞株（4T1-miR155），应用miR-155inhibitor，建立瞬时转染低敲miR-155的4T1细胞模型（4T-miR155-inh），Taqman探针法实时定量PCR检测miR-155表达。2倒置显微镜下观察转染细胞形态，以转染相应无关miR（4T1-NC）为对照，应用MTS法检测高表达miR-155对肿瘤细胞增殖的影响。Westernblot检测miR-155与EMT相关的蛋白（E-cadherin、vimentin）分子的表达的关系，并通过免疫荧光予以证实。应用低敲miR-155的4T1细胞模型，Western blot检测与EMT相关的蛋白（E-cadherin、vimentin）分子的表达，MTS法检测细胞增殖情况。利用Transwell小室检测miR-155在4T1细胞迁移中的作用，平板克隆形成实验检测高表达miR-155的4T1细胞在体外的克隆形成能力，实时定量PCR检测CXCR4表达，通过caspase3/9活性检测及TUNNEL实验检测miR-155对凋亡的影响，最后通过体内实验观察荷瘤小鼠肿瘤大小及生存期，研究高表达miR-155对4T1细胞在体内外各种生物学行为的影响。3为进一步探讨miR-155在4T1中的作用机制，Western blot检测与增殖、凋亡、及细胞周期相关蛋白（p-AKT、p-ERK1/2、FOXO3a及p-FOXO3a、p27、p21、p15）的表达，PI染色检测细胞周期变化。4应用乳腺癌一线化疗药物阿霉素进行体内外实验，探讨miR-155与化疗药物的关系。阿霉素以终浓度0μg/mL、0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.8μg/mL、1.6μg/mL，作用于4T1细胞，48h后MTS检测各孔OD值，确定阿霉素体外肿瘤细胞的作用浓度。阿霉素以选定浓度作用于4T1细胞，检测阿霉素作用后miR-155的表达变化。5MTS增殖实验检测阿霉素作用前后4T1-NC及4T1-miR155的增殖情况，caspase3/9活性检测及TUNNEL实验检测miR-155对凋亡的影响，PI染色检测阿霉素处理后各组细胞周期变化。结果：1成功建立高表达及低敲4T1细胞模型，Taqman探针法实时定量PCR检测miR-155表达，结果显示，在高表达模型中，与4T1-NC相比，4T1-miR-155细胞中miR-155上调759±39倍；在低敲细胞模型中，与相应对照相比，低敲模型中miR-155下降81%。2倒置显微镜下观察细胞形态发现，过表达miR-155的4T1-miR-155细胞由梭型的间质样表型变为鹅卵石样的上皮样表型，进一步应用Western blot检测与EMT相关分子的表达发现，与对照组相比，过表达miR-155细胞上皮标志物E-caherin表达上调，而间质标志物vimentin表达下降，免疫荧光结果与该结果一致。抑制miR-155表达时，对上皮标志物E-caherin的影响无统计学差异，而间质标志物vimentin表达增加。3MTS检测各组细胞增殖能力，结果发现，与对照组相比，过表达miR-155细胞增殖能力明显降低，而抑制miR-155表达对增殖无影响。4划痕实验及Transwell小室检测肿瘤细胞迁移能力，结果发现，与对照组相比，过表达miR-155细胞迁移能力显著下降。实时定量PCR检测CXCR4表达，结果显示，4T1-miR155组细胞CXCR4表达显著降低。5平板克隆形成实验结果显示，将细胞以300个/孔接种于6孔板，两周后观察克隆形成情况，结果发现，4T1-miR155组细胞克隆形成能力降低。6caspase3/9活性检测及TUNNEL实验结果显示，过表达miR-155并未诱导细胞发生凋亡。7动物实验观察荷瘤小鼠肿瘤大小及生存期，结果显示，接种4T1-miR155组细胞的小鼠肿瘤生长缓慢，生存期明显延长。8Western blot研究发现，过表达miR-155活化AKT， p-AKT水平增加，p-AKT进一步使下游FOXO3a发生磷酸化，p-FOXO3a表达水平增加。9细胞周期结果显示，与4T1-NC相比，4T1-miR155细胞G0/G1期比例增加（4T1-miR15566.96±1.40%vs4T1-NC36.98±1.56%），过表达miR-155诱导细胞周期G0/G1期阻滞。10MTS检测OD值，通过SPSS软件分析4T1IC50值为（0.8±0.12）μg/mL。体外实验以0.7μg/mL作为阿霉素的实验用浓度。4T1细胞经阿霉素作用48h，实时定量PCR结果显示，miR-155表达增加（4.5±1.5）倍。11MTS增殖实验结果显示，4T1-NC经阿霉素处理后，增殖速度明显减慢（P<0.01），而4T1-miR155组经阿霉素处理后，在第0h、24h、48h，其增殖速度与未处理组差别无显著性意义，在第72h，增殖速度显著低于未经阿霉素处理的4T1-miR155组（P<0.01）。12Caspase3/9活性检测结果显示，与未经阿霉素处理的4T1-NC相比，4T1-NC经阿霉素处理后， caspase3活性明显增强(P<0.05)，caspase9活性无改变。4T-miR155组经阿霉素处理前后，Caspase3/9活性无改变(P>0.05)。13TUNEL检测结果显示，经阿霉素处理后，4T1-NC大量细胞出现凋亡，而4T1-miR155组细胞凋亡细胞明显少于4T1-NC。14细胞周期结果显示，经阿霉素处理后4T1-NC细胞G0/G1期比例显著减少，G2/M期比例显著增加，与未经DOX处理的对照细胞相比，P<0.01，差别具有显著性；而4T1-miR155组细胞经阿霉素处理后，与未经阿霉素处理的4T1-miR155相比，G0/G1期比例降低，S期比例增加，G0/G1期与S期的变化均有统计学差异（P<0.01）。4T1-miR155组与4T1-NC对照组相比，经阿霉素处理后，处于G0/G1期的细胞明显增加（P<0.01），而处于G2/M期的细胞数显著下降（P<0.01）。结论：1成功建立miR-155高表达及低敲的4T1细胞模型。2miR-155过表达可促进4T1向上皮方向转化，细胞增殖、迁移、侵袭能力下降，体外肿瘤克隆形成能力下降，体内小鼠生存期延长；敲低miR-155则相反。3miR-155可通过诱导细胞周期G0/G1期阻滞及通过AKT/FOXO3a途径影响肿瘤增殖及迁移能力。4miR-155诱导4T1细胞休眠。5在4T1细胞中，miR-155对阿霉素的化疗具有拮抗作用。