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肺癌是世界上最常见和最致命的恶性肿瘤之一。由于肺癌生物学特性复杂,恶性程度高,治疗效果不理想,使其成为危害人们生命健康的首要疾病。研究发现,肺癌中存在着许多基因的异常剪接变体,例如Bc1-xL、CD44v6、Cyc1in D1b及VEGF189等,这些肿瘤相关基因的剪接变体对肺癌细胞生物学特性产生非常重要的影响。由此看来,研究肺癌发生发展相关基因的异常可变剪接对肺癌的诊断和治疗具有重要的意义。MY06,中文全称为肌球蛋白6,在人类的胚胎、心、肾、脑、肠、耳蜗等多种组织细胞中均有表达。本实验前期二代测序法分析基因可变剪接表达差异,发现在多种肿瘤组织中,对比正常组织,MY06基因存在剪接变体差异表达的情况。然而,目前有关MY06特异性剪接变体对肿瘤生物学的影响及相关机制还未见报道。尤其MY06LI这一特异剪接变体对肺癌细胞A549恶性生物表型的影响及调节机制尚不明确。因此,我们应用RNA干扰技术抑制MY06LI剪接变体的表达,检测其对A549细胞的恶性生物表型的影响及相关调节机制,为以MY06LI剪接变体为靶点的肿瘤诊断和治疗奠定坚实的理论基础。主要的实验结果如下:1.MY06基因剪接变体在各种细胞系中的表达情况。RT-PCR联合DNA测序检测到肺癌细胞A549中以表达两种MY06剪接变体为主,分别是MY06LI和MY06NI;与正常肺上皮细胞16HBE 比较,其中MY06LI剪接变体在A549细胞中呈特异性高表达。此外,在肝癌细胞系、子宫癌细胞系和卵巢癌细胞系中,MY06基因也存在多种可变剪接体。由于在肺癌细胞A549中MY06LI高表达比较突出,我们即选定肺癌开展相关研究。2.靶向MY06LI剪接变体的siRNAs抑制效果鉴定。设计靶向MY06LI剪接变体的两条siRNA序列,LI-siMY06-1和LI-siMY06-2以及购买抑制MY06所有剪接变体表达的商品化All-siMY06。利用RT-PCR和western blot技术分别在mRNA和蛋白质水平上证明了,本研究采用的siRNAs都发挥了预期的干涉作用,可用于后续研究。3.siRNAs抑制MY06LI剪接变体对肺癌细胞A549增殖的影响及调节机制。首先,利用MTT法检测了 siRNAs对A549细胞活力的影响,siRNAs抑制MY06LI剪接变体的表达明显抑制肺癌细胞A549的活力。接着,Ki67免疫荧光染色、BrdU掺入及细胞平板克隆实验,进一步证明了 siRNAs抑制MY06LI剪接变体的表达明显抑制肺癌细胞A549的增殖。并且western blot分析发现siRNAs抑制A549细胞的增殖能力可能与抑制ERK1/2 MAPK、p38/MAPK和P13K-AKT等增殖相关通路的活化有关。4.siRNAs抑制MY06LI剪接变体对肺癌细胞A549凋亡发生的影响及调节机制。首先,DAPI免疫荧光染色、Annexin V-FITC/PI双染流式检测实验证明siRNAs抑制MY06LI剪接变体的表达可以抑制肺癌细胞A549的凋亡。接着,通过western blot分析发现siRNAs抑制MY06LI剪接变体的表达可通过激发死亡受体、线粒体/细胞色素C和内质网应激等三条凋亡途径诱导肺癌细胞A549发生凋亡。5.siRNAs抑制MY06LI剪接变体的表达对肺癌细胞A549迁移侵袭能力的影响及调节机制。首先,划痕实验和Transwell细胞迁移实验证明siRNAs抑制MY06LI剪接变体的表达可以抑制肺癌细胞A549细胞的迁移能力。接着,Transwell细胞侵袭实验证明siRNAs抑制MY06LI剪接变体的表达可以抑制肺癌细胞A549的侵袭能力。最后,western blot分析发现siRNAs抑制MY06LI剪接变体的表达抑制肺癌细胞A549迁移侵袭能力,可能的分子机制之一是逆转A549细胞EMT过程。综上所述,肺癌细胞A549中,siRNAs抑制MY06LI剪接变体的表达与抑制全部MY06表达产生相似的效果。说明,在A549细胞中高表达的MY06LI剪接变体在细胞增殖、抵抗凋亡及迁移侵袭等方面可能发挥着主导作用。