胚胎干细胞(ES，Embryonic Stem cells)来自囊胚内细胞团(ICM，Inner CellMass)，以自我更新和多向分化潜能的特性在干细胞研究和应用相关领域备受重视，人胚胎干细胞不仅为临床上细胞移植、组织工程的应用开辟了广阔前景，也是研究人类早期胚胎发生、细胞组织分化、基因表达调控等发育生物学事件的理想模型之一。但其应用的安全性尚存在众多争议。近年来研究表明：表观遗传学的改变多发生在胚胎早期，并且在发育和细胞增殖过程中能稳定传递，因此有越来越多的研究建议将表观遗传学各个方面的稳定性纳入胚胎干细胞的鉴定内容之中。　　 X染色体失活(XCI，X Chromosome Inactivation)是指哺乳动物雌性胚胎中一对X染色体中的某一条在转录水平上的沉默，位于X染色体上的多达1000个基因沉默使雄性和雌性性别连锁基因的表达量平衡，是哺乳动物雌性个体维持剂量补偿效应的机制，也是表观遗传学研究重要组成部分。XCI的选择和启动发生在囊胚期，由X失活中心(XIC，X-Inactivation Center)控制。XIC中XIST基因(X Inactivation Specific Transcript)的缺失将导致XCI失败。XCI的过程为：XIST基因编码XIST-RNA，包裹在合成它的X染色体上，随后不断积累和扩展，招募一些对基因沉默有意义的因子如PCG蛋白从而诱导DNA甲基化和组蛋白修饰的发生，这对于XCI的建立和维持有重要作用。而保留活性的X染色体表达TSIX RNA(XIST Antisense RNA)，抑制XIST的转录调控。　　 XCI状态在不同的女性人胚胎干细胞系中存在差异。Dhara和Benvenisty报道，在未分化的女性人胚胎干细胞中，两条X染色体都是有活性的，但是Hall等人的研究发现在未分化的人胚胎干细胞中，也存在着XCI的现象，研究结果的不同可能足由不同系和同系的亚代之间差异产生的，而胚胎干细胞系之间不同的表观遗传状态也反映了其来源的胚胎质量、胚胎年龄以及内细胞团分离技术和长期传代培养的环境之间的差异。现已建立的多株人胚胎干细胞系虽然都证实其特异性标志物的表达，但其XCI状态的不同可能会对这些细胞系的表观遗传特征产生影响，特别是可能导致发育早期的一些调控过程的改变。　　 孤雌激活人卵母细胞是利用电化学方法，通过提高胞浆内钙离子浓度、抑制第二极体排出保证胚胎染色体为二倍体，在其发育成囊胚后通过分离ICM建立核型为(46，XX)的孤雌人胚胎干细胞系。虽然其核型与正常女性相同，但其两条X染色体都是母源性的，是否也存在XCI现象?其XCI的状态与正常的女性人胚胎干细胞足否相同?目前尚缺乏研究回答以上问题。　　 本研究利用我中心实验室建立的两株人卵母细胞孤雌激活形成的胚胎干细胞系作为研究对象，探求未分化的人孤雌胚胎干细胞(hPESCs，humanParthenogenetic Embryonic Stem Cells)的X染色体失活状态，观察一系列XCI标记物在其早、中、晚代培养过程中的表达情况，并与双亲来源的女性人胚胎干细胞(hESCs，human Embryonic Stem Cells)进行比较，同时也初步研究了人孤雌胚胎干细胞与双亲来源的女性人胚胎干细胞在X-连锁基因单核苷酸多态性(SNP，Single Nucleotide Polymorphism)位点的表达状况。　　 第一部分、人孤雌胚胎干细胞X染色体失活标记物表达的分析　　 目的：　　 研究未分化的人孤雌胚胎干细胞X染色体失活(XCI)状态，观察一系列XCI标记物在其早、中、晚代培养过程中的表达情况，并与双亲来源的女性人胚胎干细胞进行比较。　　 材料：　　 选择女性子宫内膜基质细胞(ESCs，Endometrial Stromal Cells)作为XCI的阳性对照模型，男性包皮成纤维细胞(HFFs，Human Foreskin Fibroblasts)作为XCI的阴性对照模型，实验组中共有三株已经过鉴定的人胚胎干细胞，其中两例为卵母细胞孤雌激活形成的入胚胎干细胞hPESCs-1和hPESCs-2，另一例为IVF双亲来源的女性人胚胎干细胞hESCs。　　 方法：　　 在这五个细胞系中，分别进行了染色体核型、XIST-DNA和X-着丝粒的荧光原位杂交、XIST和TSIX实时荧光定量PCR、XIST-RNA荧光原位杂交、组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化(H3K27me3，Histone H3 Lysine27 Trimethylation)免疫荧光及Barr小体染色等检测，并将三株人胚胎干细胞早、中、晚代次的XIST和TSIX基因的表达情况、H3K27me3状况和Barr小体阳性率分别同阳性模型ESCs进行了比较。　　 结果：　　 1.阳性对照模型ESCs的XCI标记物明显：包括两条X染色体着丝粒附近存在X染色体失活中心上的XIST基因、细胞中表达XIST基因、XIST-RNA和H3K27me3在细胞中呈一团状聚集、Barr小体阳性率为20.33％等，而阴性对照模型HFFs中缺乏XCI标记物。　　 2.两株人孤雌胚胎干细胞在体外长期培养过程中维持正常核型，两条X染色体上都存在XIST基因，且在早、中、晚代次中保持一致。　　 3.两株人孤雌胚胎干细胞与双亲来源的女性人胚胎干细胞hESCs中的XCI标记物状态相似，表现为：XIST基因均为低水平表达；XIST-RNA荧光原位杂交结果与之相符，在克隆团细胞中未发现明显的XIST-RNA团状聚集；细胞中H3K27me3呈散在分布，未形成积聚状态；早、中、晚各代次的三株人胚胎干细胞Barr小体阳性率明显低于阳性对照组ESCs，差异具有统计学意义(P＜0.001)。　　 4.随着体外培养代次的增加，实验组三株人胚胎细胞的XIST表达量明显上升，差异具有统计学意义(P＜0.05)，但都显著低于阳性对照模型(P＜0.001)；hPESCs-1在第35代、65代及95代的XIST表达量分别高于相应代次的hPESCs-2和hESCs，差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 5.五个细胞系均表达TSIX基因，除第95代的hPESCs-1和第35代的hPESCs-2外，其他各株细胞TSIX的表达量实验组与对照组之间的表达量差异有统计学意义(P＜0.05)；实验组三株人胚胎干细胞中TSIX的表达量随体外培养代次的增加发生变化，相同细胞系在不同代次之间TSIX表达量的差异均有统计学意义(P＜0.05)；阳性对照模型ESCs中XIST与TSIX表达量的比值为14491.61，显著高于实验组。　　 6.实验组三株人胚胎干细胞随着体外培养代次的增加，三株人胚胎干细胞的Barr小体阳性率均升高，每株胚胎干细胞早、中、晚各代次之间Barr小体阳性率的差异具有统计学意义(P＜0.05)；处于早、中、晚各代次时，三株人胚胎干细胞之间Barr小体阳性率的差异均没有统计学意义(P＞0.05)。　　 第二部分、人孤雌胚胎干细胞和女性人胚胎干细胞中X-连锁基因单核苷酸多态性位点表达状况的初步分析　　 目的：　　 初步研究了人孤雌胚胎干细胞X-连锁基因SNP位点表达状况，并与双亲来源的女性人胚胎干细胞进行比较。　　 材料：　　 与第一部分相同　　 方法：　　 1.DNA测序：在GeneBank上查找X染色体连锁的相关基因序列及其中的SNP位点，根据具体位点设计合成引物，提取细胞DNA并进行扩增、纯化DNA后用测序仪测序、应用软件分析测序结果，确定杂合的SNP位点。　　 2.cDNA测序：针对DNA测序结果中杂合的SNP位点设计合成引物，提取细胞RNA，行逆转录和cDNA的扩增，纯化cDNA后测序，并分析测序结果。　　 结果：　　 1.DNA测序结果：通过对所选X连锁基因上的14个SNP位点进行测序，阴性对照组HFFs所有测序位点均为纯合，阳性对照组ESCs和实验组三株人胚胎干细胞中存在部分杂合位点。　　 2.在ESCs中有5个杂合位点，分别为POLA1-rs929313、CXORF22-rs4412518、CXORF22-rs7350355、ATP7A-rs2227291和HS6ST2-rs5933220;在hESCs中有6个杂合位点，分别为POLA1-rs929313、GK-rs6526997、DMD-rs228406、HS6ST2-rs5933220、CXORF12-rs2266890和CXORF12-rs7350355；hPESCs-1和hPESCs-2杂合位点相同，均为CXORF22-rs4412518和CXORF22-rs7350355。　　 3.cDNA测序结果：ESCs和hESCs中部分杂合位点呈等位基因双表达。　　 结论：　　 1.在未分化的两株人孤雌胚胎干细胞中，绝大多数细胞未发生X染色体失活，而同实验室建系的一株双亲来源的女性人胚胎干细胞也具备两条有活性的X染色体，且在X-连锁基因的杂合位点呈双等位基因表达。　　 2.随着体外培养时间的增加，X染色体失活标记物在人孤雌胚胎干细胞中的表达有所上升，但远未能达到正常女性体细胞中X染色体失活状态的水平，因此认为未分化的人孤雌胚胎干细胞可能处于X染色体失活的前状态。