论文部分内容阅读
目的:分析四逆散及含药血清中药物成分，确定其体内外物质基础，研究四逆散含药血清对肝干细胞的增殖、抗氧化损伤、诱导分化作用及机制，探索四逆散在肝病治疗中的可能机理，为四逆散更好地临床应用提供科学依据。 方法:采用HPLC-MS-MS法，梯度洗脱，测定四逆散及血清中有效成分，色谱条件:Betasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，流动相A∶水，B∶乙腈，流速为1.0 mL/min，柱温为35℃，质谱采用ESI源全离子扫描方式，负离子检测，在m/z100-1200范围内进行扫描，通过相对分子质量、质谱数据及相关信息确定四逆散水提物体外成分与血中物质基础;用含药血清作用WB-F344细胞24、48、72 h后，CCK-8方法检测细胞活性;用100μmol/L H2O2处理40 min后，加四逆散含药血清作用24 h，CCK-8方法检测细胞活性，DCFH-DA染色、丙二醛(Methane Dicarboxylic Aldehyde，MDA)试剂盒检测细胞ROS含量及MDA含量，Hoechst33342染色观察细胞核的变化，Annexin-V/PI双染检测细胞凋亡率，并分析蛋白Caspase3、Bax、Bcl-2蛋白水平，观察含药血清抗氧化损伤情况;Western blot法检测甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)、白蛋白(albumin，ALB)、角蛋白-19(Cytokeratin-19，CK-19)、细胞色素P4501A1、2B1、3A(CYP1A1，CYP2B1，CYP3A)的表达，免疫荧光法定位观察AFP、ALB在细胞中的变化，RT-PCR检测AFP、ALB的mRNA水平，Elisa试剂盒检测细胞上清液中AFP、ALB的水平，Mito Tracker Red染色法检测线粒体数目，JC-1染色检测线粒体膜电位，Clark氧电极检测细胞耗氧量，DCFH-DA染色检测细胞内活性氧(Reactiveoxygen species，ROS)生成，PAS法检测糖原合成功能，尿素氮检测试剂盒观察尿素氮合成功能，研究四逆散含药血清对肝干细胞分化作用及细胞功能的影响;Western blot观察表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)、成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast Growth Factor Receptor，FGFR)、转化生长因子β受体Ⅰ型（Transforming Growth Factor beta Receptor typeⅠ，TGF-βRⅠ）、肝细胞生长因子受体(Hepatocyte Growth Factor Receptor，HGFR)、蛋白表达情况，观察四逆散含药血清诱导肝干细胞分化机制是否与EGFR、HGFR等细胞因子受体有关;血糖试纸检测细胞葡萄糖的消耗量，乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)检测试剂盒检测LDH、PK活性，乳酸、丙酮酸测定试剂盒检测乳酸、丙酮酸含量，荧光素酶法测定细胞内ATP含量，分析含药血清对糖代谢的影响。 结果:在四逆散水提物中，检测到甘草苷、橙皮苷、柚皮苷、柴胡皂苷a等成分，在四逆散血清中，检测到芍药苷、橙皮苷等成分以原型入血，还检测到橙皮素葡萄糖醛酸等部分代谢物。含药血清对细胞无毒性作用;10％含药血清具有抗H2O2引起的细胞损伤作用，降低受损细胞中ROS的含量，降低细胞MDA水平，降低细胞凋亡率;同时，10％含药血清显示出较好的促进细胞增殖及分化的效果，肝干细胞分化标志物AFP的蛋白及基因水平有降低趋势，ALB的蛋白及基因水平有升高趋势，CK-19蛋白水平无明显改变;线粒体数目、膜电位、耗氧率、ROS都有一定程度增加;糖原合成功能、尿素氮合成功能提高，CYP3A蛋白水平有一定增加，CYP1A2，2B1蛋白水平无明显改变;含药血清作用细胞后，EGFR、FGFR、TGF-βRⅠ、HGFR蛋白表达水平上升，细胞葡萄糖消耗量、乳酸生成量、LDH活性降低，PK活性、丙酮酸含量、ATP含量上升。 结论:四逆散含药血清能够促进肝干细胞增殖、对抗氧化应激损伤，诱导细胞分化，分化机制可能与EGFR、HGFR等细胞因子受体及调控细胞糖代谢有关，本研究提出了四逆散在肝病临床治疗中可能的新作用机理。