目的:本项目拟通过PI3K/AKT/HIF-1α信号通路探讨再生医疗技术促进慢性难愈合创面修复的部分分子机制,结合前期课题研究结果,进一步完善慢性难愈合创面的病理机制研究,为慢性难愈合创面的治疗提供思路及参考。同时也为完善再生医疗技术在慢性难愈合创面上的作用机制,为再生医疗技术在临床上的推广应用增强科学理论依据。方法:90只从广西医科大学购买的SPF级别大鼠,均为雄性大鼠。购买后饲养在右江民族医学院SPF级别动物科学实验中心,随机分为:空白组、急性组及慢性难愈合创面组,其中空白组的大鼠不做任何有损伤性处理,急性组行全层皮肤缺损处理,慢性难愈合创面组是首先进行全层皮肤缺损处理,再参照付小兵等全层皮肤缺损法和沈氏改良塑料环肉芽肿定量法经改进制成的大鼠慢性难愈合创面。即在行全层皮肤切除后注射氢化可的松。慢性难愈合创面组再按造模后的处理方法不同随机分为慢创组(即模型组),贝复新组及美宝组,慢创组即造模后无药物干预治疗;贝复新组是造模后使用贝复新药物干预治疗;美宝组是造模后使用再生医疗技术(moist exposed burn therapy/moist exposed burn ointment,MEBT/MEBO)干预治疗。各组创面制备后立即用药治疗。各组换药前均以1/5000呋喃西林液清洁创面,每日换药2次。动物模型制备完成后,每天使用SONY摄像机拍摄创面,以便创面愈合率分析;各组于造模后3d、7d、14d共3个时相点随机取6只大鼠腹腔麻醉后,切取整个创面肉芽组织。所取组织部分放入甲醛中固定,之后行HE染色及CD31免疫组化检查,余下样品迅速冻于-80℃冰箱,收集所有时相点的组织标本后统一进行Western blot检测。从宏观的创面愈合率及病理切片的炎症细胞浸润和血管新生,到微观的蛋白分子信号转导通路上研究慢性难愈合创面的病理机制及再生医疗技术在慢性难愈合创面的潜在机制。结果:(1)创面愈合率,除空白组外,各组愈合率均逐渐上升,在14d观察时相点,急性组创面的愈合率为:0.965±0.019,慢创组创面的愈合率为:0.468±0.013,贝复新组创面的愈合率为:0.975±0.007,美宝组创面的愈合率为:0.974±0.002。慢创组与急性组的P<0.001,慢创组与贝复新组的P<0.001,慢创组与美宝组的P<0.001,均有统计学差异。急性组与贝复新组的P=0.630,急性组与美宝组的P=0.709,贝复新组与美宝组的P=0.935,均无统计学差异。(2)HE染色,急性组为急性炎症细胞浸润-中性粒细胞,急性组术后3d表现为创面水肿,后续创面水肿消失,出现血管新生,并在14d出现了毛囊,提示创面愈合完成。慢性难愈合创面表现为慢性炎症细胞浸润-淋巴细胞,且在贝复新组及美宝组与慢创组的对照中,可看出前两组被干预治疗后的慢性炎症细胞浸润明显减少,而慢性组持续存在淋巴细胞浸润,组织水肿特征。在术后7d,贝复新表现出胶原蛋白增多,14d出现了上皮细胞,提示创面的上皮移行已覆盖创面。而美宝组术后7d出现了血管新生,14d出现了毛囊,提示创面愈合完成。空白组无明显变化。(3)CD31免疫组织化学染色观察新生血管,在第3d时,空白组血管计数为:2.610±0.979,急性组血管计数为:3.720±0.826,慢创组血管计数为:2.610±1.043,贝复新组血管计数为:4.060±1.056,美宝组血管计数为:4.220±1.309。空白组血管计数与慢创组无统计学差异,P=0.209;而急性组与贝复新组、美宝组无统计学差异,分别P=0.345,P=0.158;贝复新组与美宝组的血管计数无统计学差异,P=0.636。在第7d时,空白组血管计数为:2.560±0.784,急性组血管计数为:10.610±1.290,慢创组血管计数为:7.280±1.873,贝复新组血管计数为:8.330±1.749,美宝组血管计数为:9.670±1.847。慢创组与贝复新组的血管计数无统计学差异,P=0.420;急性组与美宝组的血管计数无统计学差异,P=0.404;贝复新组与美宝组的血管计数无统计学差异,P=0.196。在第14d时,空白组血管计数为:2.670±0.840,急性组血管计数为:6.500±1.295,慢创组血管计数为:5.220±0.732,贝复新组血管计数为:6.390±1.243,美宝组血管计数为:6.500±0.985。急性组与贝复新组、美宝组的血管计数无统计学差异,分别P=0.999,P=1.000;贝复新组与美宝组的血管计数无统计学差异,P=0.998。(4)Western-Blot检测PI3K/AKT/HIF-1α信号转导通路表达情况,PI3K,P-AKT的结果趋势我们已在前期中发表,依据实验设计,检测了PI3K/AKT的下游分子,HIF-1α/VEGFR2。(1)HIF-1α的蛋白表达结果,在第3d时,空白组HIF-1α的蛋白表达为:0.472±0.023,急性组HIF-1α的蛋白表达为:1.066±0.092,慢创组HIF-1α的蛋白表达为:0.976±0.042,贝复新组HIF-1α的蛋白表达为:1.540±0.075,美宝组HIF-1α的蛋白表达为:1.484±0.056。HIF-1α的蛋白表达量中,只有贝复新组与美宝组统计学无差异,P=0.133;在第7d时,空白组HIF-1α的蛋白表达为:0.455±0.016,急性组HIF-1α的蛋白表达为:0.963±0.033,慢创组HIF-1α的蛋白表达为:0.839±0.021,贝复新组HIF-1α的蛋白表达为:1.394±0.051,美宝组HIF-1α的蛋白表达为:1.227±0.055。各组之间均有统计学差异;在第14d时,空白组HIF-1α的蛋白表达为:0.458±0.026,急性组HIF-1α的蛋白表达为:0.862±0.032,慢创组HIF-1α的蛋白表达为:0.830±0.064,贝复新组HIF-1α的蛋白表达为:1.047±0.092,美宝组HIF-1α的蛋白表达为:1.000±0.086。急性组与慢创组的HIF-1α的蛋白表达量无统计学差异,P=0.407;贝复新组与美宝组统计学无差异,P=0.234。而HIF-1α的蛋白表达趋势为:空白组由于未作任何特殊处理,其表达水平无明显变化,P>0.05;急性组、慢创组、贝复新组及美宝组的HIF-1α的蛋白表达趋势为持续降低,HIF-1α的蛋白表达量均为3d>7d>14d。(2)VEGFR2的蛋白表达结果,在第3d时,空白组VEGFR2的蛋白表达为:0.746±0.018,急性组VEGFR2的蛋白表达为:1.156±0.098,慢创组VEGFR2的蛋白表达为:0.971±0.053,贝复新组VEGFR2的蛋白表达为:1.119±0.061,美宝组VEGFR2的蛋白表达为:1.096±0.069。VEGFR2的蛋白表达量中,急性组与贝复新组、美宝组统计学无差异,分别P=0.335,P=0.125,贝复新组与美宝组统计学无差异,P=0.551;在第7d时,空白组VEGFR2的蛋白表达为:0.736±0.044,急性组VEGFR2的蛋白表达为:2.085±0.077,慢创组VEGFR2的蛋白表达为:1.616±0.037,贝复新组VEGFR2的蛋白表达为:1.970±0.070,美宝组VEGFR2的蛋白表达为:1.902±0.029。急性组与贝复新组统计学无差异,P=0.124,贝复新组与美宝组统计学无差异,P=0.286;在第14d时,空白组VEGFR2的蛋白表达为:0.742±0.043,急性组VEGFR2的蛋白表达为:0.956±0.059,慢创组VEGFR2的蛋白表达为:0.948±0.056,贝复新组VEGFR2的蛋白表达为:0.937±0.051,美宝组VEGFR2的蛋白表达为:0.943±0.038。急性组与慢创组、贝复新组、美宝组的VEGFR2的蛋白表达量无统计学差异,分别P=0.786,P=0.515,P=0.645,慢创组与贝复新组、美宝组的VEGFR2的蛋白表达量无统计学差异,分别P=0.703,P=0.849;贝复新组与美宝组统计学无差异,P=0.848。VEGFR2的蛋白表达趋势为:空白组由于未作任何特殊处理,其表达水平无明显变化,P>0.05;急性组、慢创组、贝复新组及美宝组的VEGFR2的蛋白表达趋势为先增高后降低,VEGFR2的蛋白表达量7d>3d>14d。结论:(1)MEBT/MEBO能够促进慢性难愈合创面的愈合,且在慢性难愈合创面的大鼠模型中与贝复新具有相似的愈合率;(2)MEBT/MEBO能够通过促进慢性难愈合创面的血管新生,增加血液循环,减少淋巴细胞的浸润,改善慢性难愈合创面中的慢性炎症反应;(3)MEBT/MEBO能够激活PI3K/AKT/HIF-1α信号转导通路,促进血管新生的关键因子-VEGFR2的表达,以此促进创面的血管新生,改善创面的乏氧状态,达到慢性难愈合创面的愈合;(4)MEBT/MEBO在慢性难愈合创面中的技术应用可进一步在临床中推广。