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一、目的为探讨柚皮素对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用及其可能机制,本研究以SD大鼠为实验对象,分别采用体外原代皮层神经细胞培养糖氧剥夺/再灌注(oxygen and glucose deprivation/reperfusion,OGD/Rep)模型和大鼠大脑中动脉缺血再灌注(MACO)模型,从体外和动物模型不同角度探索柚皮素干预对脑缺血再灌注损伤的保护作用及其与线粒体功能失调以及核因子E2相关因子(Nrf2)通路调控的抗氧化应激的关系,明确柚皮素对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用的分子机理。二、方法体外研究实验:1、用NES-FITC及DAPI对对数生长期的大鼠皮层神经元细胞进行免疫荧光染色鉴定。2、SD大鼠大脑皮层神经细胞建立OGD/Rep模型。3、(1)用不同浓度NAR干预48h后,检测细胞凋亡情况。(2)检测凋亡蛋白Capase-3、bax、bcl-2、CytC蛋白和基因表达水平。(3)电镜观察各组线粒体结构,检测其膜电势和腺苷酸含量变化。(4)检测ROS、MDA和GSH水平及SOD活性。4、(1)siRNA-Nrf2、OENrf2 干扰 Nrf2 表达,行 OGD/Rep 处理,再给予80MmNAR处理48h后,检测细胞凋亡情况。(2)检测ROS、MDA和GSH水平及SOD活性。(3)检测Nrf2蛋白转移情况以及其与ARE结合的情况。(4)检测Nrf2、Keap1、HO-1和NOQ1蛋白和基因表达水平。体内研究实验:1、利用线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注(MCAO)动物模型,给予不用浓度NAR处理,术后进行神经行为学评分、TTC染色、脑含水量测定以及HE染色。2、给予MCAO模型不同浓度NAR处理72h后,(1)电镜扫描观察各组线粒体结构,检测其膜电势和腺苷酸含量变化;(2)检测脑组织内ROS、MDA和GSH水平及SOD活性;(3)观察脑组织神经细胞凋亡情况,检测脑组织Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1 蛋白表达情况,检测 Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1基因表达情况,同时检测Nrf2的DNA结合活力和Keap1亚硝基化情况。三、结果体外研究结果:1、与正常对照相比,模型组细胞活性低,凋亡率高,差异显著(P<0.05),与模型组对比,不同浓度NAR预处理后,细胞活性提高、凋亡率下降,NAR-H组最为显著(P<0.05)。2、与正常组比较,模型组Capase-3,bax及CytC表达上调,bcl-2表达下调(P<0.05)。与模型组相比,经过不同浓度NAR预处理后,Capase-3,bax及CytC表达下调,bcl-2表达上调。其中NAR-H组最为显著(P<0.05)。3、NAR预处理可改善线粒体形态,提高其膜电位及腺苷酸合成能力,提高 SOD、GSH水平,降低 ROS、MDA水平。4、与模型组比较,转染OENrf2组和NAR组细胞活性提高,凋亡率下降,OENrf2组最为显著(P<0.05);转染Nrf2-siRNA组则相反(P<0.05)。5、与模型组比较,转染OENrf2组和NAR组SOD、GSH水平提高,ROS、MDA水平下降,OENrf2组最为显著(P<0.05);转染Nrf2-siRNA组则无明显差异(P>0.05)。7、与模型组比较,转染OENrf2组和NAR组细胞质Nrf2蛋白表达增加,而胞浆表达减少,OENrf2组最为显著(P<0.05);转染Nrf2-siRNA组差异无统计学意义(P>0.05)。8、NAR诱导Nrf2表达,促进Nrf2通路下游蛋白Nrf2、Keap1、HO-1和NOQ1的表达。体内研究结果:1、NAR预处理组脑梗死面积、神经行为学评分和脑水含量均显著优于模型组。2、NAR预处理组线粒体正常结构增加、膜电位增强、腺苷酸合成能力提高,氧化应激水平降低,与模型对照组相比,差异具有统计学意义。3、NAR预处理组细胞凋亡减少,提高Keap1巯基亚硝基化水平、增强Nrf2 DNA活性,激活Nrf2通路下游Nrf2、Keap1、HO-1和NOQ1的表达。四、结论柚皮素对体外细胞培养氧糖剥夺/再灌注模型和大鼠脑缺血再灌注模型中的神经细胞均具有明显的保护作用,该作用与其改善线粒体结构和功能失调以及激活Nrf2介导的抗氧化应激活性相关。