【摘 要】
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目的:观察Bcl-6在慢性髓细胞白血病（CML）伊马替尼（IM）耐药发生中的作用并探讨其作用机制。方法:（1）IM对野生型CML细胞株K562及其IM耐药细胞株K562/G01的细胞增殖抑制作用通过CCK-8方法测定,由SPSS20.0计算K562/G01耐药倍数。（2）K562以及K562/G01细胞中原癌基因Bcl-6 m RNA和蛋白水平分别采用荧光定量PCR（quantitative re
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目的:观察Bcl-6在慢性髓细胞白血病（CML）伊马替尼（IM）耐药发生中的作用并探讨其作用机制。方法:（1）IM对野生型CML细胞株K562及其IM耐药细胞株K562/G01的细胞增殖抑制作用通过CCK-8方法测定,由SPSS20.0计算K562/G01耐药倍数。（2）K562以及K562/G01细胞中原癌基因Bcl-6 m RNA和蛋白水平分别采用荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,q PCR）方法和免疫印迹（Western blot）技术测定。（3）采用小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）--Bcl-6 si RNA下调K562/G01细胞株中Bcl-6的蛋白水平,分别采用CCK-8方法和流式细胞术检测Bcl-6 si RNA干扰后K562/G01细胞的增殖率和细胞凋亡水平。（4）采用c-MYC抑制剂--10058-F4抑制K562及K562/G01细胞株c-MYC蛋白的表达水平,分别采用CCK-8方法和流式细胞术检测10058-F4处理后K562和K562/G01细胞的增殖率和细胞凋亡水平。（5）采用Bcl-6 si RNA下调K562/G01细胞Bcl-6蛋白水平,应用荧光定量PCR和免疫印迹技术检测干扰Bcl-6蛋白表达对c-MYC m RNA和蛋白表达水平的影响。（6）分别以5μmol/L和10μmol/L终浓度的蛋白酶抑制剂--MG-132处理K562及K562/G01细胞株,运用免疫印记技术检测处理前后Bcl-6蛋白泛素化水平的差异。（7）运用免疫沉淀（IP）技术观察K562及K562/G01细胞Bcl-6泛素化水平的差异。（8）分别应用q PCR技术和免疫印迹技术检测K562及K562/G01细胞USP2、USP7、USP14三种去泛素化蛋白酶蛋白和m RNA表达水平。（9）采用USP2特异性抑制剂--ML364抑制USP2蛋白酶,采用免疫印记技术检测ML364处理前后K562/G01细胞株Bcl-6蛋白表达水平的变化。结果:（1）IM对K562细胞的IC50为0.75μmol/L,对K562/G01细胞的IC50为5.62μmol/L,计算得出K562/G01细胞对IM的耐药倍数为8倍。（2）q PCR检测结果证实:K562/G01细胞Bcl-6 m RNA表达水平高于K562细胞;免疫印迹检测结果证实:K562/G01细胞Bcl-6蛋白水平高于K562细胞。（3）Bcl-6 si RNA可通过下调K562/G01细胞Bcl-6蛋白的表达水平而促进K562/G01细胞凋亡和抑制其增殖。（4）10058-F4可抑制K562/G01细胞c-MYC蛋白的表达,促进K562/G01细胞凋亡和抑制其增殖。（5）q PCR及免疫印迹检测结果证实:Bcl-6si RNA干扰可下调K562/G01细胞c-MYC m RNA和蛋白的表达水平。（6）K562/G01细胞株Bcl-6蛋白受泛素化调控。（7）q PCR和免疫印迹检测结果证实:K562/G01细胞的USP2 m RNA及蛋白水平高于K562细胞。（8）USP2特异性抑制剂-ML364处理可下调K562/G01细胞株Bcl-6蛋白的表达水平。结论:Bcl-6 m RNA和蛋白表达水平上调以及USP2介导的Bcl-6蛋白泛素化水平下调提高了Bcl-6蛋白稳定性共同导致CML细胞高表达Bcl-6蛋白,表达水平升高的Bcl-6与c-MYC协同作用导致CML细胞对IM发生耐药,抑制Bcl-6或c-MYC的表达均可诱导IM耐药CML细胞凋亡和抑制其增殖。
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