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肺动脉高压（pulmonary hypertension,PH）的重要临床特征是肺动脉（pulmonary arteries,PAs）压力持续增高和重塑,主要由于肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs）胞浆内不断升高的游离Ca2+浓度(intracellular free calcium concentration,[Ca2+]i)导致的。研究表明,PASMCs的异常是肺动脉高压发生发展的重要病理学特征,其钙稳态的失衡以及增殖凋亡失衡是肺血管重塑的关键。研究表明,严重PH患者的肺组织炎症与氧化应激（Oxidative stress）相关,在心血管系统中为活性氧（Reactive oxygen species,ROS）主要来源的NADPH氧化酶（NADPHoxidase,Nox）蛋白家族表达显著增加,并且瞬时受体电位（transientreceptor potential,TRP）超家族中唯一一个氧化敏感型通道瞬时受体电位M型2（transient receptor potential melastatin 2,TRPM2）的表达也显著上升。然而,Nox家族与TRPM2在肺动脉高压中的作用机制尚不明确。本研究在正常（control,CON）和慢性低氧性肺动脉高压（chronic hypoxia-induced pulmonary hypertension,CHPH）大鼠中,首先检测PAs中Nox家族和TRPM2的表达,继而探讨Nox和TRPM2对5-HT及CH介导的PASMCs增殖迁移凋亡变化的影响,以及PH发展过程中Nox家族蛋白主要作用的亚型及其与TRPM2功能之间的关系,从而为PH发病机制的阐明及其靶向治疗提供新的科研依据。第一部分CHPH大鼠中不同Nox亚型对大鼠PASMCs增殖、迁移和凋亡的影响目的:检测CHPH大鼠PAs中Nox家族基因表达的变化,观察不同Nox亚型对大鼠PASMCs增殖迁移凋亡的影响。方法:清洁级雄性SD大鼠常压CH处理3周构建CHPH大鼠模型,在此基础上采用:（1）血流动力学检测方法检测大鼠右心室收缩压（right ventricular systolic pressure,RVSP）,分别计算两组模型中右心室重量指数（right ventricular mass index,RVMI）的变化;（2）实时荧光定量PCR和Western blot检测方法,测定大鼠去内皮PAs中Nox亚型m RNA和蛋白的表达水平;（3）MTS法和Ed U掺入法,观察CHPH对PASMCs增殖的作用以及Nox抑制剂（Nox1抑制剂:ML171;Nox2抑制剂:gp91ds-tat;Nox4抑制剂:GKT137831）对5-HT及CH介导的PASMCs增殖水平的影响;（4）划痕愈合法和Transwell小室法,观察CHPH对PASMCs迁移的作用以及三种抑制剂对5-HT及CH对PASMCs迁移水平的影响;（5）Annexin V FITC/PI试剂盒检测法,观察CHPH对PASMCs凋亡的作用以及三种抑制剂对5-HT及CH对PASMCs凋亡水平的影响（6）采用si RNA干扰技术特异性敲减Nox4基因,并观察敲减Nox4后对大鼠PASMCs增殖迁移凋亡的影响;结果:与CON组大鼠相比,（1）RVSP从CON组的24.8±0.5 mm Hg升高到CH组的50.8±0.9 mm Hg,RVMI也从CON组26.3±0.5%升高到CHPH组36.5±1.4%,提示PH大鼠模型构建成功;（2）CHPH大鼠去内皮PAs中Nox1、2、4的m RNA表达显著升高,而蛋白表达以Nox1和Nox4升高为主,提示在PH的发展过程中参与的Nox亚型主要以Nox1和Nox4为主;（3）与CON组相比,CHPH大鼠中PASMCs细胞数目显著增高（OD值由CON组的0.79±0.01增加到CH组的1.34±0.09）,且Ed U的掺入率在CHPH大鼠PASMCs也显著增加,Ed U掺入率由0.31±0.02增加到0.45±0.02,提示CHPH大鼠PASMCs中细胞增殖水平显著增强;CHPH大鼠中PASMCs 24h划痕愈合面积显著增加,且Transwell小室中迁移到下室的细胞数目在CHPH大鼠PASMCs也显著增加,由CON组的71.8±4.34增加到CH组的146.91±5.05,提示CHPH大鼠PASMCs中细胞迁移水平显著增强;CHPH大鼠中PASMCs FITC标记的Annexin V结合率显著减少,提示CHPH大鼠PASMCs中细胞凋亡水平显著抑制;（4）与CH引起的PASMCs增殖迁移增强,凋亡减少的作用相似,5-HT对CON组PASMCs也具有促进增殖迁移,抑制凋亡的作用,提示在CHPH过程中可能是通过5-HT的作用而产生的PASMCs增值迁移凋亡的改变。（5）在5-HT诱导的CON大鼠PASMCs和CHPH模型大鼠PASMCs中,ML171可抑制5-HT和CH引起的PASMCs OD值增加,以及5-HT引起的细胞增殖水平升高,但对CH引起的细胞增殖水平增加没有明显抑制作用。同时ML171可以明显抑制5-HT和CH引起的PASMCs细胞迁移。GKT137831对5-HT和CH引起的PASMCs增殖和迁移均有显著的抑制作用,但gp91 ds-tat对5-HT和CH引起的PASMCs增殖和迁移均无显著的抑制作用。在细胞凋亡中,ML171、gp91ds-tat和GKT137831均可以进一步促进5-HT引起的细胞凋亡抵抗,而在CH组中,三种抑制剂均可以减少慢性低氧引起的细胞凋亡抵抗至正常水平。提示在三种Nox亚型中,对慢性低氧PASMCs增殖迁移凋亡的影响可能是以Nox4发挥主要作用;（6）特异性敲低Nox4基因均能抑制正常PASMCs的增殖迁移凋亡,与前述抑制剂的效果一致,提示Nox4对PASMCs的增殖迁移凋亡具有不可缺少的作用。结论:CH预处理3周能够成功诱导大鼠发生PH和右心肥厚;其机制可能是CHPH大鼠Nox-ROS-TRPM2信号通路中由5-HT引起Nox1和Nox4的表达显著增加,以Nox4作用为主,引起ROS的来源增加,进一步引起增殖迁移和凋亡变化,促进PAs血管重塑,导致PH的发生发展。第二部分CHPH中TRPM2对大鼠PASMCs增殖、迁移和凋亡的影响目的:观察Nox-ROS-TRPM2信号通路中TRPM2在CHPH组PAs的表达变化,以及TRPM2对5-HT诱导CON大鼠PASMCs和CHPH模型大鼠PASMCs增殖、迁移和凋亡水平的影响,进一步探讨Nox4和TRPM2在PASMCs增殖迁移上的共同作用,以明确在CHPH发病过程中Nox-ROS-TRPM2对细胞增殖迁移凋亡的调控作用。方法:（1）实时荧光定量PCR和Western blot检测方法,测定大鼠去内皮PAs中TRPM2的表达水平;（2）采用TRPM2抑制剂（2APB:100μM、ACA:30μM、PJ34:100μM）分别孵育24h,应用MTS法和Ed U掺入法,划痕愈合法和Transwell小室法,Annexin V FITC/PI试剂盒检测法,分别观察三种抑制剂对5-HT及CH诱导PASMCs增殖、迁移和凋亡的影响;（3）采用si RNA干扰技术特异性敲减TRPM2基因,并观察敲减TRPM2后对大鼠PASMCs增殖迁移凋亡的影响;（4）应用GKT137831分别和ACA、2APB、PJ34联合作用,观察同时抑制Nox4和TRPM2时,5-HT及CH诱导的大鼠PASMCs增殖迁移的变化。结果:（1）与CON组相比,CH组TRPM2的m RNA和蛋白表达明显增加,提示TRPM2参与CHPH的发生发展;（2）2APB和PJ34可显著抑制5-HT和CH引起的PASMCs增殖迁移水平增强。ACA作用较弱。但同时三种抑制剂均可促进5-HT和CH引起的PASMCs细胞凋亡;提示TRPM2参与CHPH过程中PASMCs增值迁移凋亡的调控;（3）特异性敲低TRPM2基因均能抑制正常PASMCs的增殖迁移凋亡,提示TRPM2对PASMCs的增殖迁移凋亡具有不可缺少的作用。（4）GKT137831与ACA、2APB和PJ34分别联合用药,均可以不同程度度抑制5-HT以及CH引起的PASMCs增殖迁移,提示Nox4和TRPM2在CHPH过程中PASMCs引起的增殖迁移中起协同作用。结论:在CHPH过程中TRPM2表达增强。抑制TRPM2通道均能够显著抑制PASMCs的增殖迁移,并促进凋亡,表明TRPM2参与CHPH发生发展过程中的PASMCs的增殖迁移凋亡调控,在与Nox4同时抑制时,5-HT以及CH引起的PASMCs增殖迁移也被抑制,提示Nox4与TRPM2具有协同作用,TRPM2可能作为Nox4的下游信号调控细胞的增殖迁移凋亡。第三部分Nox4-ROS-TRPM2信号通路在CHPH发病中的作用目的:观察Nox4基因敲除(Nox4-/-)对CHPH的影响以及Nox4-/-对5-HT介导的PASMCs增殖迁移凋亡的作用。观察Nox4基因敲除后TRPM2的变化。进一步明确在CHPH过程中Nox4和TRPM2通道的相互作用以及对PASMCs功能的调控。方法:（1）利用琼脂糖电泳法、western blot、PCR技术验证Nox4-/-小鼠敲除是否成功;（2）与野生型慢性低氧小鼠模型比较,观察Nox4-/-小鼠CH模型血流动力学和RVMI的变化。（3）利用MTS法、划痕愈合法和Annexin V FITC/PI标记法观察Nox4-/-对5-HT诱导的PASMCs增殖迁移凋亡的影响。（4）Western blot和PCR技术检测Nox4-/-小鼠中TRPM2的表达。结果:（1）琼脂糖电泳法显示Nox4-/-小鼠的DNA条带在300bp左右,高于野生型小鼠的DNA条带228bp,提示Nox4-/-小鼠的基因型是纯合子Nox4-/-。Western blo和PCR技术显示与野生型小鼠肺组织相比,Nox4-/-小鼠的Nox4 m RNA和蛋白表达水平几乎没有,提示Nox4基因敲除成功,保证实验的准确性。（2）与野生型小鼠慢性低氧模型比较,Nox4-/-小鼠CH模型中肺动脉压力明显降低、RVMI也显著减小。提示Nox4基因的缺失可以降低CHPH过程中因CH引起的RVSP、RVMI升高,提示Nox4-/-有利于CHPH的预防。（3）与野生型小鼠的PASMCs比较,Nox4-/-可以有效抑制5-HT引起的PASMCs增殖和迁移,且进一步促进PASMCs凋亡,提示Nox4基因确实对CH过程中PASMCs增殖迁移凋亡有不可缺少的作用。（4）与野生型小鼠肺组织相比,Nox4-/-小鼠中TRPM2的m RNA和蛋白的表达水平增加,提示Nox4与TRPM2存在相互调节作用。综上所述,PASMCs中氧化应激水平的增加导致Nox表达和功能活性的增强以及TRPM2功能的上调在CHPH致病过程中发挥了重要作用。CH通过5-HT上调Nox家族主要作用亚型Nox4的表达,通过产生过量的ROS激活TRPM2通道进而调控PASMCs[Ca2+]i变化,引起细胞增殖迁移凋亡水平的变化,导致血管重塑,促进PH的发生发展。此外,在Nox4-/-小鼠中CH所致血管重塑能够有效缓解,且5-HT诱导的细胞增殖迁移也显著降低,进一步表明Nox4在肺动脉高压发生发展中的氧化应激反应起重要作用。Nox4-/-小鼠中TRPM2表达增加,说明TRPM2依赖于Nox4而作用。以上结果为阐明PH的发病机制和PH的靶向治疗提供新的科研依据。