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研究目的:探讨DEPTOR蛋白表达水平差异在多发性骨髓瘤(MM)细胞中的意义。研究方法:收集我院2015.10.01-2017.06.30间住院的22例初诊MM患者临床资料及骨髓标本,同时进行随访(截止时间2019年01月);通过CD138磁珠分选出骨髓液原代MM浆细胞(PCs);CD34免疫组化染色检测骨髓活检标本的骨髓微血管密度(MVD)。Western blot技术检测分选PCs及MM细胞株DEPTOR及血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的表达情况。研究结果:RPMI 8226细胞株DEPTOR表达量最高,VEGF表达量最低;MM.1S细胞株DEPTOR和VEGF表达量居中,U266细胞株DEPTOR表达量最低,VEGF表达量最高。不同病人原代PCs的DEPTOR及VEGF蛋白表达情况各不相同;不同病人骨髓MVD情况也各不相同,22个病人MVD从16.84个/mm2到412.46个/mm2(中位MVD为176.77个/mm2);原代PCs的DEPTOR蛋白表达量与VEGF蛋白表达(r=-0.8402)及MVD(r=-0.828)呈负相关,p<0.05;VEGF表达量与病人骨髓MVD呈正相关(r=0.9583,p<0.05)。以DEPTOR相对表达量中位灰度值0.132为界,将22例病人分为高表达及低表达组,每组各11人;MM患者临床特征与ISS分期在DEPTOR蛋白高表达组与DEPTOR蛋白低表达组,组间差别无统计学意义,p>0.05;DEPTOR蛋白高表达组生存时间(OS)与DEPTOR蛋白低表达组,组间差别无统计学意义,p>0.05。结论:初诊MM患者骨髓PCs的VEGF相对表达量与MVD呈正相关;原代PCs的DEPTOR蛋白表达量与VEGF蛋白表达量及MVD呈负相关。研究目的:采用CRISPR/Cas技术构建靶向抑制DEPTOR基因的慢病毒载体研究方法:采用CRISPR相关蛋白9(Cas9)与单引导的RNA(sg RNAs)被用来沉默MM细胞株DEPTOR基因表达。根据靶点设计原则设计了针对DEPTOR基因的3个靶点,体外合成对应的sg RNA,并将其与Cas9慢病毒载体连接,挑选阳性克隆送测序;将构建成功的载体与包装质粒共转染293FT细胞,收集上清中慢病毒颗粒浓缩,并进行滴度测定;慢病毒GFP、DEP1、DEP2及DEP3感染RPMI 8226细胞72 h(MOI=40),提取细胞总RNA,根据靶点设计PCR引物序列并进行PCR扩增,将扩增后的PCR产物采用CruiserTMEnzyme酶切后行琼脂糖凝胶电泳;同时将PCR产物片段进行测序。Western blot验证靶向抑制DEPTOR基因后蛋白沉默情况。研究结果:阳性克隆测序结果提示成功构建DEPTOR-sg RNA1、DEPTORsg RNA2及DEPTOR-sg RNA3的Cas9慢病毒载体DEP1、DEP2及DEP3;慢病毒载体DEP1、DEP2及DEP3进行慢病毒包装、浓缩后滴度分别为2.36×108 TU/m L、2.0×109 TU/m L及5×108 TU/m L;慢病毒感染RPMI 8226细胞,感染72 h细胞感染荧光超过80%。CruiserTMEnzyme酶切PCR产物,琼脂糖凝胶电泳结果显示混合池出现酶切条带,证实混合池出现DEPTOR基因破坏;对DEPTOR片段扩增进行碱基测序,测序结果显示:与GFP阴性对照组相比,DEP1、DEP2感染组出现CGG碱基缺失;DEP3感染组出现T碱基缺失。Western blot证实DEP3感染组DEPTOR蛋白靶向抑制效果最好。结论:成功构建DEPTOR-sg RNAs的Cas9慢病毒载体,同时筛选出效率最高的sg RNA慢病毒载体DEP3。研究目的:探讨靶向抑制DEPTOR对MM细胞株血管新生的影响及可能机制。研究方法:采用慢病毒GFP、DEP3感染MM细胞株RPMI8226(MOI=40)和MM.1S(MOI=30),CCK8检测细胞增殖率;感染72 h后;收集培养基上清,Matrigel小管形成实验评价脐静脉内皮细胞株(HUVEC)血管新生能力;用线粒体Mito-SOX红色荧光探针染色,荧光显微镜及流式细胞术检测线粒体ROS情况;酶标仪检测NF-κB报告基因质粒p NFκB-TA-luc的荧光素酶表达分析NF-κB的活性;Western blot检测细胞DEPTOR蛋白,自噬相关蛋白Beclin 1和LC3Ⅱ/Ⅰ,VEGF蛋白,Cyt C蛋白,NF-κB信号通路相关蛋白IκB-α、p-p65和p-p50表达;ELISA检测培养基上清中白介素6(IL-6)及VEGF蛋白表达量。研究结果:与GFP感染组相比,DEP3感染组DEPTOR蛋白在MM细胞株RPMI8226和MM.1S中的表达明显降低,自噬相关蛋白Beclin 1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达明显降低;靶向抑制DEPTOR可以抑制MM细胞株RPMI 8226及MM.1S的细胞增殖,促进HUVEC管样结构形成能力。靶向抑制RPMI 8226细胞株DEPTOR,管样结构数目由(6.5±2.3)个增加至(11.33±1.98)个;靶向抑制MM.1S细胞株DEPTOR,管样结构数目由(7.3±1.3)个增加至(12.05±1.87)个,组间差别有统计学意义,p<0.05;靶向抑制MM细胞株DEPTOR后Cyt C由线粒体进入胞浆;靶向抑制RPMI 8226细胞株DEPTOR,线粒体Mito-SOX荧光强度由(36154±3021)增加至(42138±4340);靶向抑制MM.1S细胞株DEPTOR,线粒体Mito-SOX荧光强度由(37564±2135)增加至(51321±4166),与GFP组相比,组间差别有统计学意义,p<0.05;DEP3感染组较GFP感染组NF-κB报告基因质粒p NFκB-TA-luc荧光素酶表达增加,细胞核内NF-κB通路相关蛋白p-p65及p-p50水平升高,培养基上清IL-6及VEGF蛋白表达量均出现明显增加,组间差别有统计学意义,p<0.05。结论:MM细胞株靶向抑制DEPTOR表达后细胞自噬水平受到抑制,同时通过激活线粒体ROS聚集促进NF-κB信号通路活化及下游IL-6及VEGF表达,促进HUVEC管样结构形成能力。研究目的:研究自噬在靶向抑制DEPTOR的MM细胞株RPMI 8226和MM.1S血管新生中作用及机制。研究方法:采用慢病毒GFP、DEP3感染MM细胞株RPMI 8226和MM.1S 72 h后,分别加入自噬增强剂雷帕霉素(100 n M)或线粒体ROS清除剂Mito-TEMPO(10μM)作用24 h;收集培养基上清,Matrigel小管形成实验评价HUVEC小管形成能力;用线粒体Mito-SOX红色荧光探针染色,流式细胞术检测线粒体ROS情况;Western blot检测细胞DEPTOR蛋白,自噬相关蛋白Beclin 1和LC3Ⅱ/Ⅰ,VEGF蛋白,Cyt C蛋白,NF-κB信号通路相关蛋白IκB-α、p-p65和p-p50表达;ELISA检测培养基上清中IL-6及VEGF蛋白表达量。研究结果:雷帕霉素和Mito-TEMPO均可逆转靶向抑制DEPTOR表达的MM细胞株RPMI 8226和MM.1S促血管新生作用;雷帕霉素成功激活了靶向抑制DEPTOR介导的MM自噬抑制,自噬相关蛋白Beclin 1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达明显升高;雷帕霉素和Mito-TEMPO均可减少靶向抑制MM细胞株DEPTOR导致的Cyt C由线粒体进入胞浆;靶向抑制DEPTOR的RPMI 8226细胞组,加入雷帕霉素或Mito-TEMPO后Mito-SOX荧光强度分别下降为(28172±3765)和(25320±4132),均较对照组Mito-SOX荧光强度(41320±4003)明显减低(p<0.05),靶向抑制DEPTOR的MM.1S细胞组,加入雷帕霉素或Mito-TEMPO后Mito-SOX荧光强度分别下降为(30214±2922)和(33159±3207),均较对照组的Mito-SOX荧光强度(51321±2166)明显减低(p<0.05);雷帕霉素和Mito-TEMPO均可逆转RPMI 8226细胞株和MM.1S细胞株靶向抑制DEPTOR诱导的细胞核内NF-κB通路相关蛋白p-p65及p-p50水平升高及其下游的IL-6及VEGF表达,组间差别均有统计学意义,p<0.05。结论:细胞自噬通过调控线粒体ROS影响NF-κB信号通路及其下游IL-6及VEGF表达,参与靶向抑制DEPTOR诱导的MM细胞血管新生。