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哺乳动物卵子及早期胚胎体外培养技术的兴起,为卵母细胞体外成熟、体外胚胎发育、母源基因向合子基因调控的转换、个体发育启动(信息、物质、能量)机制研究、孵化囊胚植入等诸多科学问题的研究提供了技术基础和保障。目前小鼠等实验动物的卵子及早期胚胎体外培养系统越来越成熟,与此同时,科研工作者们在牛、羊、猪、马等家畜中进行了大量的相关实验研究。本研究中,首先以牛卵母细胞体外成熟和体外受精技术为基础,在牛卵母细胞体外受精后48小时向牛的合成输卵管液(Synthetic Oviduct Fluid:SOF)中添加Y27632,2i/lif和透明质酸酶,分别调控Rock、Wnt、MEK/ERK、LIF/Stat和CD44/MAPK信号通路。通过统计体外胚胎的卵裂率和囊胚率,揭示不同培养条件对牛早期胚胎发育的影响,结果显示:10μM Y27632培养条件下第七天囊胚发育率较高;同时,对体外受精获得的囊胚进行免疫荧光染色,比较囊胚期胚胎的总细胞数、内细胞团(Inner Cell Mass:ICM)细胞数和滋养层(Trophectoderm:TE)细胞数,探讨调控不同信号通路对牛早期胚胎发育中细胞分化命运决定的影响,结果显示:添加Y27632培养条件下的囊胚TE细胞数显著高于对照组SOF中的囊胚TE细胞数,表明Y27632促进牛滋养层细胞增殖;此外,我们将发育液中Y27632的浓度设置10μM 50 μ和100 μM三种不同浓度梯度,研究不同浓度梯度的Y27632对牛早期胚胎发育的影响。研究结果显示:在浓度为10μMY27632培养条件下,体外受精囊胚的发育率显著升高,表明牛体外受精胚胎发育受Y27632的浓度影响。另外,添加2i/lif和透明质酸酶组中的胚胎与对照组中的胚胎相比,囊胚率、胚胎总细胞数、TE细胞数和ICM细胞数均无明显差异;实验结果表明,外源添加2i/lif和透明质酸酶对牛早期胚胎体外发育无显著影响。近年,科研工作者对大鼠、仓鼠、水貂、绵羊、兔、猪、牛等动物开展了建立胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells:ESCs)的大量研究,但除了小鼠的ESCs细胞以外,其他动物的胚胎干细胞在形态和多能性方面都与小鼠ESCs有很大的区别,被称为类胚胎干细胞。在本研究中,,利用上述牛体外受精胚胎,使用添加 AFR(Activin A,bFGF,KSR)、AFY(Activin A,bFGF,Y27632)的培养基以及人和猪的ESCs培养体系,建立牛ESCs细胞系。接种96枚胚胎,其中19枚胚胎形成outgrow(贴壁生长),AFY培养体系经机械传代后能传到第四代。碱性磷酸酶染色(AP)结果显示,AFY培养体系显示为阳性,而人和猪的ESCs培养体系呈弱阳性。本研究表明,使用AFY培养体系可以维持牛胚胎干细胞的增殖与稳定的自我更新至第四代,同时细胞表达ESCs多能性基因Oct4,Sox2,和Nanog。利用AFY培养基以及人和猪的ESCs培养体系初步建立了牛类胚胎干细胞培养的新技术,为进一步研究牛胚胎干细胞提供了可靠的实验依据。