高产黄色素红曲霉菌种选育及其液态发酵工艺优化的研究

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红曲色素作为一种天然色素,其安全性高,故现已广泛应用于各种食品着色剂。在食品安全问题日益受到关注的今天,由此类天然色素取代人工合成色素的前景广阔。红曲色素属于聚酮类色素,由六种结构相近的成分组成,其中,Ankaflavine与Monascin为黄色素,Rubropunctatine与Monascorubrine是桔黄色素,Rubropunctamine与Monascorubramine为红色素。其中黄色素作为一类主要的食用色素的品种,通常占市场需求量的60%,故红曲黄色素的开发研究具有广阔的前景及重大的经济效益。日本目前已实现了红曲黄色素的工业化生产。尽管红曲黄色素在国内已有市售产品,但发酵色价不到30个色价单位,或黄色素色价能达到80以上但黄色素色调不到1。而国外的专利和文献报道,选育出的菌株液态发酵的色价高或色调水平比较高,色调能达到3~4,但黄色素色价不到60;黄色素色价达到60左右但色调不到1.5;泰国研究者通过诱变得到单产黄色素的菌株,但经过二十多年的研究还未实现工业化生产。因此菌种的选育是关键问题。本文先研究选育产黄色素的红曲霉菌,然后进行发酵优化机理研究,期待早日实现红曲黄色素的工业化生产。   通过物理化学复合诱变得到一株产红曲黄色素比较高的红曲霉突变菌株(Monascus anka mutant MYM),其代谢生成的黄色素在410 nm附近有最大吸收峰并且在广pH范围内稳定性比较好。对影响红曲霉突变菌株代谢生成黄色素的发酵条件如培养基初始pH和培养温度以及在250 mL三角摇瓶(广口)中其它培养参数如摇床转速等进行了研究,确定了在250 mL三角瓶摇床培养系统中最适培养基初始pH为4.0,培养温度为32℃,摇床转速为200 r/min,接种量为8%,三角瓶装液量为75 mL/250 mL,三角瓶口纱布层数为6层。   对影响红曲霉突变菌株代谢生成黄色素和提高发酵液黄色素色调的碳源,氮源,无机盐,金属盐等进行了研究,选出有利于红曲霉突变菌株代谢生成黄色素和提高发酵液黄色素色调的碳源(葡萄糖和可溶性淀粉),氮源(玉米浆和氯化铵),无机盐(磷酸二氢钾)和金属盐(氯化钙和硫酸锰)。并通过响应面方法,以提高胞内黄色素色价和发酵液胞内黄色素色调为目标,对以上主要影响营养参数进行培养基优化,最终发酵培养基组成如下(g/L):可溶性淀粉70,葡萄糖20,玉米浆10,磷酸二氢钾5,氯化铵15,氯化钙0.1,硫酸锰0.7,初始pH4.0。在5L生物反应器上进行了分批发酵验证,结果表明胞内黄色素的最大色价达到92.45 U/mL,此时胞内黄色素色调为5.57。   在摇瓶和5升发酵罐的基础上,证明铵盐形成的pH环境能明显影响了红曲霉突变菌株代谢生成色素和桔霉素的能力。从产量上而言,铵盐对黄色素代谢生成量和菌体生成量没明显影响,但对红色素和桔霉素代谢生成影响很明显。铵盐对黄色素代谢生成过程影响明显,不同的铵盐形成了发酵液的不同pH环境。硝酸铵能完全消除桔霉素的代谢生成但有利于红色素的代谢生成。相对于硫酸铵而言,氯化铵既能消除桔霉素的代谢生成也不利于红色素的代谢生成。对突变菌株代谢生成的两种黄色素进行MS和NMR分析,证实两种黄色素分别为Ankaflavin和Monascin。突变菌株与原始出发菌株在同样培养条件下进行发酵培养对比,发现突变菌株代谢生成黄色素的能力远高于原始出发菌株,并且发酵液的黄色素色调远高于原始出发菌株发酵液的黄色素色调。以上三个方面实验结果表明红曲霉突变菌株代谢形成高比例黄色素的重要原因有二:一是因为经过物理化学复合诱变导致决定红色素代谢生成关键酶的酶活受到抑制或决定黄色素代谢生成关键酶的酶活得到提高;二是因为培养基优化导致发酵液pH很低从而明显抑制了决定红色素代谢生成关键酶的酶活,而决定黄色素代谢生成关键酶的酶活没受到低pH环境抑制或抑制程度远远低于对红色素代谢生成关键酶酶活的影响。   研究证明生物素有利于红曲黄色素的代谢生成,而碳酸氢铵、碳酸氢钠和柠檬酸无论添加量多少对黄色素代谢生成和红曲霉突变菌株生长都是有十分不利的影响。在四种乙酸盐研究中,除了乙酸钙和乙酸锌对其代谢生成黄色素有促进作用之外,其余乙酸盐都是不利于的。乙酸离子并没有参与黄色素的代谢生成和作为菌生长的底物。   乳酸作为一种生长底物和代谢底物被红曲霉突变菌株利用,是有利于黄色素的代谢生成。在本文研究中,橄榄油有利于胞内黄色素的代谢生成,其余的食用油都不利于黄色素的代谢生成。芝麻油能促进桔霉素代谢生成,茶油能明显消除桔霉素的代谢生成。吐温80和吐温20对黄色素的代谢生成有影响,并且能明显消除桔霉素的代谢生成。在本文研究中,除了酪氨酸和天冬氨酸有利于黄色素代谢生成外,其余都不利于黄色素的代谢生成。L-半胱氨酸盐酸盐,苯丙氨酸,组氨酸和脯氨酸能明显消除桔霉素的代谢生成,但是缬氨酸能促进桔霉素的代谢形成。   在本文研究中,相比于单一温度控制的实验结果,两阶段温度控制策略(发酵前48小时培养温度为34℃,48小时后培养温度为32℃)能提高产物相对于底物的得率,在一定程度上能明显消除桔霉素的代谢生成。两阶段温度控制发酵时黄色素色价增加量是单一温度28℃和32℃控制时的2165.48%和5.76%,黄色素比生成速率长时间维持在0.2U.g-1.h-1到0.4 U.g-1.h-1之间。   相比于单一通气控制的实验结果,两阶段通气控制(发酵96小时通气控制在0.8~1.0 vvm之间,96小时后通气控制在0.4~0.6vvm之间)发酵时黄色素提高量分别是单一通气0.4 vvm和1.0vvm时的65.75%和7.43%,两阶段通气控制能更有效的利用底物来维持菌的生长以及目标产物的代谢生成,也能明显有效消除桔霉素的代谢生成。   相比于搅拌转速的实验结果,两阶段搅拌转速控制策略(96小时前400 r/min,96小时后300 r/min)发酵时的黄色素色价增加量分别是250 r/min,300 r/min,350 r/min,400r/min和450 r/min发酵时的49.37%,49.25%,35.56%,18.73%和41.01%。两阶段搅拌转速控制能使菌生长和产物形成以较高的速率长时间实现,能明显提高底物的利用率和产物相对于底物的得率,也能缩短整个发酵周期,能有效的消除桔霉素的代谢生成。   以提高黄色素色价为目标,设计了三因素复合控制对红曲霉突变菌株发酵黄色素的实验,控制策略如下:发酵48小时前培养温度为34℃,48小时后32℃;发酵96小时前搅拌转速为400 r/min,96小时后为300 r/min;发酵48小时前通气为0.8~1.0 vvm左右,48小时后为0.4~0.6vvm之间。三因素复合控制发酵时,相比于温度,通气和搅拌两阶段控制发酵时黄色素色价增加量分别为10.56 U/mL,38.99 U/mL和25.64 U/mL。三因素复合控制发酵在一定程度能提高菌的比生长速率和延长黄色素的生成时间,并且能抑制桔霉素的代谢生成。   过高或过低的溶氧都不利于黄色素的生成。两阶段溶氧控制(发酵96小时前溶氧为40%~50%,96小时后溶氧为20%)能明显提高菌最大比生长速率以及能长时间维持较高的菌体比生长速率,能明显消除桔霉素的代谢生成。
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