N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAGase）,是一种几丁质水解酶,广泛存在于自然界中,且在许多生物学过程中起着重要作用。本实验用尼罗罗非鱼肝脏作为材料,采用硫酸铵（30～70%）分级沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱层析、Sephadex G-200分子筛柱层析的方法分离纯化NAGase,得到的酶制剂比活力为2988 U/mg。SDS-PAGE法检测提纯的酶制剂,结果仅有一条带,认为得到的酶为PAGE单一纯。凝胶层析柱法测得罗非鱼肝脏NAGase的总分子量为61.8 kD,结合SDS-PAGE结果,说明该酶仅有一个亚基。进一步研究其酶学性质,发现该酶在55℃时酶活力最高,0～55℃范围内酶活力较为稳定,超过80℃时完全丧失活性;该酶的最适pH为5.8,pH在4.0～9.0之间时酶活力较为稳定,当pH超过10时NAGase基本完全失活;该酶的动力学参数Km为0.229 mmol/L,Vm为9.3 14 μmol·L-1.min-1。运用化学修饰法研究罗非鱼肝脏NAGase活性中心的功能基团,发现NAGase活性中心的必需基团有组氨酸咪唑基残基、色氨酸残基的吲哚基、赖氨酸的ε-氨基;活性中心外必需基团有二硫键,而对NAGase的侧链精氨酸进行修饰并不会改变酶的活性,说明它不是该酶的功能基团。本文进一步研究了有机溶剂对罗非鱼肝脏NAGase催化水解底物反应活力的影响。结果发现全氟己酸、四氯化碳和乙酰胺对NAGase活性有较大影响。三种有机物对罗非鱼肝脏NAGase均为可逆抑制,其中 IC50 值分别为 0.29 mg/mL、0.26 mg/mL 和 25 mmol/L。由Lineweaver-Burk双倒数法可知,全氟己酸和四氯化碳为竞争型抑制类型,与自由酶结合的抑制平衡常数KI分别是0.18 mg/mL和0.032 mg/mL;而乙酰胺对NAGase的抑制类型为混合型抑制,其与游离酶结合的平衡常数KI为8.1 mmol/L,与酶-底物复合物结合的平衡常数KIs值为150.72 mmol/L。使用底物反应的动力学方法建立抑制动力学模型,其微观速度常数可以通过在有机物溶液中NAGase的底物反应求出。