基因治疗就是把正确的目的基因传递到细胞中进行表达,对由于基因变异和缺陷所引发的疾病进行治疗的生物医学技术。基因治疗在恶性肿瘤和遗传性疾病具有很大的潜力和很好的前景,引起研究者们广泛的关注。基因治疗的研究主要时寻找一种高效、低毒的基因转染载体,将基因药物导入细胞并能稳定地发挥其作用。用于基因载体主要有病毒基因载体和非病毒基因载体。病毒基因载体有逆转录病毒、腺病毒等,其转染效率高,但也存在安全性低,出现免疫反应等缺点。非病毒载体有阳离子聚合物,阳离子脂质体等,由于其安全性高和生物相容性好,容易获取等优点,受到越来越多的关注。阳离子端基肽类脂是非病毒基因载体中研究较多,较热门的基因载体。氨基酸及多肽类物质由于具有免疫调节,抗血栓,抗氧化等特性受到研究者们的关注,利用氨基酸或多肽作为基因载体的基本骨架或对基因载体进行修饰,可以促进基因载体的溶酶体逃逸,获得高转染效率,而且多肽安全性高,能降低基因载体的毒性。聚酰胺胺(PAMAM)是广泛应用的树枝状大分子聚合物,其末端的氨基通过质子化带正电,可以与DNA等形成复合物。以PAMAM作为端基态类脂的头部,使其有较好的水溶性、高转染率,低细胞毒性等。在基因递传递过程中存在诸多屏障,如易被存在于血液中大量的蛋白质和酶等物质降解,细胞结构中的生物膜的影响细胞的摄取,在溶酶体内被降解,从而无法有效地转移至细胞核发挥作用,因此需要对基因载体的基因传递机制进行研究。本研究以赖氨酸,酒石酸等具有较好的生物相容性,生物降解能力高,细胞靶向性,细胞毒性低,安全性高的天然产物为基础,制备赖氨酸修饰的一代聚酰胺胺为头部的阳离子端基肽类脂基因载体,并对该阳离子端基肽类脂的基因传递机制进行研究。本研究主要内容:(1)阳离子端基肽类脂的合成和结构表征:阳离子端基态类脂的合成分四步,首先是十二酰氯与酒石酸反应生成双月桂酰酒石酸酐,其次是二碳酸二叔丁酯保护的赖氨酸和G1-PAMAM反应的产物与双月桂酰酒石酸酐反应,酸酐键断开,最后经过酸化得到目标产物。最终合成化合物通过红外光谱(IR)和核磁共振氢谱(~1 H-NMR)来确定其结构,确认产物为所要合成的阳离子端基态类脂。(2)阳离子脂质体/DNA的制备及其理化性能研究:合成的阳离子端基态类脂与助类脂DOPE合成阳离子脂质体,通过琼脂糖凝胶阻滞实验考察该阳离子脂质体压缩DNA的能力;通过Zetas izer Nano Series 90粒径分析仪对该阳离子脂质体的粒径和电势进行测定。实验结果表明该合成的阳离子端基态类脂可以完全压缩DNA,并具有合适的粒径和电位,可以进行转染。(3)阳离子端基态类脂及其DNA复合物的细胞毒性研究:用MTT法对不同浓度的阳离子脂质体的细胞毒性,对不同细胞系的细胞毒性,不同作用时间的细胞毒性进行考察。结果表明随着阳离子脂质体浓度的增大和作用时间的增加,细胞毒性也增加,没有表现出细胞类型依赖性。复合物的细胞毒性随重量比的增大而增大。(4)阳离子端基态类脂的基因传递机制研究:使用细胞凋亡法测定阳离子脂质体在一定的浓度下能否诱导细胞发生凋亡,细胞凋亡的效率与脂质体浓度和作用时间的关系;通过倒置荧光显微镜和细胞流式仪考察不同的阳离子脂质体/DNA重量比,不同细胞系,血清,温度和细胞摄取抑制剂对转染效率的影响;通过加入不同的细胞摄取途径抑制剂研究阳离子端基态类脂的入胞方式,并且对细胞核、溶酶体和DNA进行染色标记,通过激光共聚焦显微镜观察DNA在细胞内的分布状况。实验发现该脂质体在一定程度能诱导肿瘤细胞凋亡的能力,但是效果不明显。该阳离子脂质体进入细胞的主要内吞途径是小窝蛋白途径。