目的:探讨不同组织来源间充质干细胞(MSC)分泌的外泌体中Micro RNA(mi RNA)对小鼠急性移植物抗宿主病(a Gv HD)发生发展的影响。方法:(1)分别从C57BL/6小鼠骨实质和人脐带组织中分离培养MSC,采用流式细胞术鉴定其细胞表型,并进行成脂和成骨的诱导分化。14day后采用油红O染色检测其成脂分化能力,碱性磷酸酶(ALP)染色鉴别其成骨分化能力;实时荧光定量PCR(q-PCR)检测分化过程中成脂分化因子C/EBPα和PPARγ的表达以及成骨分化关键转录因子Osteocalin和Runx2的表达。进一步,采用无血清培养基培养MSC,收集培养上清,利用外泌体试剂盒分离纯化外泌体。采用流式细胞术、蛋白免疫印迹(western blot)、纳米追踪分析技术和透射电镜等方法,依据外泌体大小、形态、膜表面标志物鉴定分离获得的外泌体,并对外泌体的mi RNA进行测序,结合生物信息学分析,选择保守性强且高表达的mi RNA-223-3p(mi R-223-3p)进行进一步的研究。(2)以正常C57BL/6为受体小鼠,由尾静脉输注射小鼠骨实质来源MSC(mb MSC),48h后采集外周血并分离血清外泌体,采用western blot鉴定外泌体膜表面标志物,q-PCR检测移植MSC后血清外泌体的mi R-223-3p的改变。(3)将MSC外泌体与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共培养24h,q-PCR和western blot检测共培养后HUVEC的mi R-223-3p表达与其靶基因细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达变化。进一步,将mi R-223-3p mimic和对照(NC)分别转染HUVEC,q-PCR和western blot检测过表达mi R-223-3p对ICAM-1的基因水平和ICAM-1蛋白水平的改变。(4)以C57BL/6为供鼠,为BALB/c受体小鼠,建立小鼠a Gv HD模型。体外培养的P3代MSC、mi R-223-3p mimic和NC分别通过尾静脉输注a Gv HD小鼠,观察各组小鼠的一般生长状况和生存情况的改变,并进行a Gv HD临床评分和移植后小鼠的白细胞水平的检测。流式细胞术检测移植后受体小鼠中供体淋巴细胞迁移能力和脾脏淋巴细胞内IFN-γ的表达,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清中炎症因子的表达,冰冻切片观察供体淋巴细胞在脾脏、肺、肠、肝脏的归巢情况。结果:(1)成功分离培养获得小鼠骨实质来源和人脐带来源的MSC,符合国际细胞治疗协会规定的金标准,即MSC呈典型的长梭形、涡旋状生长,高表达间质细胞表面标志物CD105、CD29、CD73、CD166,高表达干性表面标志物Sca-1,不表达或低表达白细胞表面标志物CD45,内皮细胞表面标志物CD31以及造血干细胞表面标志物CD34。14d后油红O染色检测结果表明,诱导组细胞出现大量的脂滴;ALP染色结果显示,诱导组的碱性磷酸酶活性高于自分组。q-PCR检测结果表明,诱导组MSC高表达成脂分化关键因子C/EBPα分和PPARγ以及成骨分化关键转录因子Osteocalin和Runx2,上述结果证实,我们分离获得了小鼠骨实质和人脐带来源的MSC。进一步,收集MSC无血清培养上清,分离纯化MSC外泌体,流式细胞术检测结果表明,hu MSC外泌体高表达CD63和CD81;western blot检测结果显示,两种MSC外泌体均表达外泌体标志物CD63、TSG101;纳米追踪分析技术结果显示,分离获得的外泌体的粒径均在100nm左右,透射电镜的检测结果进一步证实,分离的外泌体膜泡是杯状结构、大小为100nm。上述结果说明,我们成功分离获得了MSC分泌的外泌体。对两种不同来源MSC外泌体进行mi RNA测序,经生物信息学筛选和比对,发现mi R-223-3p在两种MSC外泌体中均高表达。(2)为进一步证实MSC外泌体的体内功能,将mb MSC输注C57BL/6鼠,48h后检测小鼠外周血血清外泌体的改变,western blot检测结果表明,分离的外泌体高表达其标志物CD63和TSG101;q-PCR检测结果表明,输注MSC后血清外泌体中高表达mi R-223-3p,与对照组相比,差异具有统计学意义(p<0.001)。上述研究结果提示,MSC在体内促进血清外泌体高表达mi R-223-3p。(3)为探讨MSC外泌体的作用机制,我们将MSC外泌体与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共培养,q-PCR检测结果表明,与外泌体共培养的HUVEC高表达mi R-223-3p,与对照组相比差异显著(p<0.001);western blot检测结果证实mi R-223-3p的作用靶基因ICAM-1在HUVEC中表达下调,上述结果提示MSC外泌体可通过传递膜内mi R-223-3p调控细胞中靶基因ICAM-1的表达。进一步,将mi R-223-3p mimic和阴性对照(NC)转染HUVEC,q-PCR检测结果表明,转染mi R-223-3p mimic后促进HUVEC的mi R-223-3p表达升高,并显著下调ICAM-1的基因表达,western blot结果亦证实ICAM-1蛋白水平表达也下调。(4)将mi R-223-3p mimic和NC输注a GVHD小鼠模型,观察其对小鼠a GVHD的发生发展影响。结果表明,mi R-223-3p mimic可显著促进a GVHD小鼠饮食、体重和活动度等一般生长状况及造血恢复,生存期延长。流式细胞术检测结果显示,mi R-223-3p可抑制供体淋巴细胞迁移至受体小鼠脾脏,淋巴细胞胞内的炎症因子IFN-γ表达显著下降。冰冻切片结果表明,mi R-223-3p可抑制供体淋巴细胞归巢至受体小鼠脾脏、肝脏、肺和肠组织;ELISA结果显示mi R-223-3p抑制血清中炎症因子IFN-γ的分泌。结论:MSC外泌体通过高表达mi R-223-3p抑制HUVEC的ICAM-1表达,进而抑制小鼠a Gv HD供体淋巴细胞归巢与炎症因子IFN-γ分泌,上述结果提示MSC外泌体通过mi R-223-3p抑制早期小鼠a Gv HD的发生。